基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中成藥治療胸痹配伍規(guī)律及潛在機制研究

姚昆鵬，劉起立，張道平，石 靜，蔡子杰，蔡虎志，陳新宇，*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

胸痹是指以胸部悶痛，甚則胸痛徹背，不得平臥為主要表現(xiàn)的一類病證。中醫(yī)學(xué)對胸痹的記載始見于《靈樞·五邪》，曰：“邪在心，則病心痛。”[1]歷代醫(yī)家對胸痹分別加以論述，并提出“猝心痛”“厥心痛”“真心痛”等病名，直至仲景《金匱要略》方才提出“胸痹”之名稱，并將其病機歸納為“陽微陰弦”[2]。由于輕者表現(xiàn)為胸部悶痛，呼吸不暢，重則胸痛劇烈，冷汗淋漓，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多將其歸屬于冠心病范疇[3-4]。截至2020年，流行病學(xué)統(tǒng)計顯示，中國心血管疾病患病人數(shù)3.3億，其中冠心病患者高達1 100萬人[5]。冠心病全稱動脈粥樣硬化性心臟病，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)將其分為慢性冠脈病與急性冠狀動脈綜合征。冠心病具有高發(fā)生率、高病死率的特點，且不穩(wěn)定型心絞痛及急性心肌梗死的患病人數(shù)逐年上升[6]。由于心肌細胞損傷的不可逆性，冠心病患者的預(yù)后較差，生活質(zhì)量下降。若出現(xiàn)急性心肌梗死，甚則危及患者生命。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多予以藥物、冠脈支架植入術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)等方法進行干預(yù)，但大量研究表明，仍有患者不能耐受上述治療，或存在復(fù)發(fā)等不良后果[7]。中醫(yī)藥具有低毒副作用、效佳價廉的特點。隨著近年來對傳統(tǒng)醫(yī)藥研究的深入，多種中成藥制劑也投入到冠心病的臨床治療中。2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)是國家藥品監(jiān)督管理局國家藥典委員會頒布的法典，旨在提升藥物治療、保障用藥安全。通過文獻檢索發(fā)現(xiàn)，已有對藥典所收錄的中藥飲片的歸類及組方配伍的相關(guān)研究，或?qū)ζ涫珍浀某煞街苿┗騿挝吨苿┻M行數(shù)據(jù)挖掘[8-11]，鮮少見到針對胸痹這一中醫(yī)病證名的中成藥數(shù)據(jù)挖掘，并探析其潛在作用機制。本研究以2020年版《中國藥典》(一部)中治療胸痹的中成藥的成方名稱、中藥成分、性味歸經(jīng)、功能與主治為研究對象，采用數(shù)據(jù)挖掘及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探索《中國藥典》收錄的治療胸痹的中成藥制劑的用藥特點，并分析其潛在分子機制，為中醫(yī)藥治療胸痹及新藥研發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

根據(jù)2020年版《中國藥典》(一部)中“成方制劑和單位制劑”部分的藥物索引，依次在逐個藥物的功能與主治中選取關(guān)鍵詞為：“胸痹”“猝心痛”“厥心痛”“胸悶”“胸痛”“胸痹心痛”“冠狀動脈粥樣硬化性心臟病”“冠心病”“心絞痛”“心肌梗死”等用于治療胸痹的中成藥。對于劑型不同但藥方及藥量一致的方劑，如：穩(wěn)心片、穩(wěn)心顆粒、穩(wěn)心膠囊計為1個中成藥。

1.2 數(shù)據(jù)篩選與處理

采取雙人輸入，第三人校對審核的方式。將符合“1.1”項下條件的中成藥方中的方劑名稱、功能與主治及中藥成分錄入Microsoft Excel 2016，建立胸痹中成藥數(shù)據(jù)庫；參考2020年版《中國藥典》(一部)對納入的中藥名稱進行統(tǒng)一規(guī)范，如“九節(jié)菖蒲”“菖蒲”規(guī)范為“石菖蒲”，“炒乳香”規(guī)范為“乳香”，“炒沒藥”規(guī)范為“沒藥”，并依據(jù)2020年版《中國藥典》(一部)及“十二五”規(guī)劃的《中藥學(xué)》教材進行性味歸經(jīng)、藥物分類等。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 用藥規(guī)律的分析與預(yù)測 對“1.2”中錄入的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，運用Microsoft Excel 2016、IBM SPSS Modeler 15.0及IBM SPSS Statistics 25進行如下處理。

(1)頻數(shù)統(tǒng)計。采用Excel表格對納入數(shù)據(jù)進行頻數(shù)分析，統(tǒng)計各中成藥的頻數(shù)、性味歸經(jīng)及功效分類，并提取高頻藥物，初步歸納出中成藥治療胸痹的用藥規(guī)律及高頻藥物群。

(2)藥物關(guān)聯(lián)度分析。運用IBM SPSS Modeler 15.0中Apriori算法對使用頻次排名前20的中藥進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置條件：最小支持度為10%，最小置信度為65%，最大前項數(shù)為5。核心藥對18個。全部藥物組合的提升度都大于1，表明上述藥物組合在統(tǒng)計學(xué)上均有意義，按照置信度從大到小排序。

(3)聚類分析。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 25軟件中，對高頻藥物進行系統(tǒng)聚類分析，選擇聚類方法為組間聯(lián)合、皮爾遜相關(guān)性，最小聚類數(shù)5，最大聚類數(shù)10，得到中藥聚類組合及聚類分析譜系圖。

1.3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對藥物的深度分析 將“1.3.1”中所得的核心藥物，在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)先后進行有效成分篩選，同時在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫，使用“Coronary heart disease”作為檢索詞獲取冠心病的相關(guān)靶標，再繪制韋恩圖構(gòu)建中藥-疾病交集靶點，在Cytoscape 3.7.1中構(gòu)建藥物-疾病-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，并將基因提交至STRING網(wǎng)站繪制蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖，再利用R3.6.1軟件進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，預(yù)測2020年版《中國藥典》(一部)中治療胸痹的最高頻藥物的可能作用機制。

2 結(jié)果

2.1 藥頻統(tǒng)計

經(jīng)過數(shù)據(jù)搜集、篩選與整理，在2020年版《中國藥典》(一部)中共選取到135個中成藥制劑，其中65個為劑型不同但藥方一致，予以合并，共計81個有效中成藥處方。對符合納入標準的81個有效中成藥處方的135味中藥進行頻數(shù)統(tǒng)計、性味歸經(jīng)及藥物功效分類統(tǒng)計，結(jié)果如下。

2.1.1 納入藥物使用頻次分析 經(jīng)過篩選，最終納入中成藥制劑81個，涉及135味中藥，藥物總頻次511次。使用頻次大于10次的中藥命名為高頻藥物，共計11味，由多到少排列依次為丹參、川芎、三七、冰片、黃芪、人參、赤芍、紅花、葛根、麥冬、山楂，見表1。

表1 《中國藥典》治療胸痹中成藥的高頻藥物統(tǒng)計

2.2.2 納入藥物性味歸經(jīng)頻次分析 將納入藥物的四氣、五味、歸經(jīng)數(shù)據(jù)進行頻次分析。藥物在四氣中所占比重從大到小依次為溫(47次)>寒(42次)>平(36次)>涼(6次)>熱(4次)，見圖1A。藥物在五味中所占比重從大到小分別為苦(65次)>辛(55次)>甘(48次)>酸(14次)>咸(11次)>澀(7次)>淡(3次)，見圖1B。藥物歸經(jīng)按頻次從多至少依次為肝經(jīng)(73次)>心經(jīng)(61次)>脾經(jīng)(49次)>肺經(jīng)(45次)>腎經(jīng)(44次)>胃經(jīng)(33次)>大腸經(jīng)(15次)>膽經(jīng)(10次)>膀胱經(jīng)(8次)>心包經(jīng)(4次)>三焦經(jīng)(2次)>小腸經(jīng)(1次)，見圖1C。

圖1 《中國藥典》治療胸痹中成藥藥物的四氣、五味、歸經(jīng)統(tǒng)計

2.2.3 納入藥物功效分類 符合納入標準的藥物，按照作用分類，可以分為17類，其中補虛藥頻次居首位，藥味達30味，頻次達130次，頻率為25.44%，余下依次為活血化瘀藥、開竅藥、清熱藥、理氣藥、解表藥、止血藥、平肝熄風藥、消食藥、收澀藥、安神藥、化痰止咳平喘藥、利水滲濕藥、溫里藥、攻毒殺蟲止癢藥、祛風濕藥、涌吐藥，具體見表2。

2.2 關(guān)聯(lián)分析與聚類分析

2.2.1 《中國藥典》中治療胸痹常用藥的關(guān)聯(lián)分析 運用IBM SPSS Modeler 15.0 對所有藥物用Apriori算法進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最小支持度為10%，最小置信度為65%，最大前向項數(shù)為5，置信度由高到低排序，共核心藥對18個,見表3。

表2 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的分類統(tǒng)計分析

表3 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物組合的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.2.2 《中國藥典》中治療胸痹常用藥的聚類分析 將頻數(shù)>10的藥物列為高頻藥物，共計11種，導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 25中，對高頻進行聚類分析，選擇聚類方法為組間聯(lián)合、皮爾遜相關(guān)性，最小聚類數(shù)5，最大聚類數(shù)10，結(jié)合中醫(yī)學(xué)相關(guān)理論，得到4個中藥聚類組合，見表4、圖2。

表4 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的聚類組合

圖2 《中國藥典》中成藥治療胸痹藥物的聚類分析譜系圖

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析——核心藥物治療胸痹的潛在作用機制分析

2.3.1 核心藥物的靶標預(yù)測結(jié)果 通過數(shù)據(jù)挖掘分析，丹參、川芎、三七的使用頻率最高，且在關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中丹參、川芎、三七也均出現(xiàn)在藥味組合中，因此將上述三味藥物定義為核心藥物。在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索核心藥物的活性成分和作用靶點，并根據(jù)口服生物利用度≥30%以及類藥性≥0.18，除去重復(fù)項和未存在的映射關(guān)系，篩選出77個有效成分、242個作用靶點。通過GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫，使用“Coronary heart disease”作為檢索詞獲取冠心病的相關(guān)靶標，得到作用靶點，見表5。除去重復(fù)靶點，最終獲得疾病靶點數(shù)7 337個。

表5 冠心病相關(guān)靶標

2.3.2 核心藥物治療冠心病的蛋白、基因分析 通過Venn圖得到核心藥物的活性成分與疾病的交集靶點180個，利用STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫獲取蛋白互作關(guān)系，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，最后利用Cytoscape軟件構(gòu)建疾病-藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，外圈代表藥物的成分，內(nèi)圈代表作用靶點，靶點越大表明藥物對應(yīng)靶點越多，見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中靶蛋白之間作用關(guān)系的強弱與靶蛋白對應(yīng)的顏色深淺以及蛋白之間連線的粗細、顏色深淺呈正相關(guān)。

圖3 核心藥物-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3.3 核心藥物治療冠心病的GO及KEGG富集分析 通過數(shù)據(jù)庫Bioconductor(http：//bioconductor.org/)對核心藥物治療胸痹作用的靶標進行基因Symbol的ID轉(zhuǎn)換，運用R 語言的 ClusterProfiler、org.Hs.eg.db、enrichplot、ggplot2包進行GO和 KEGG富集分析，GO分析共獲得涉及BP(生物過程)2 509個，CC(細胞組分)112個，MF(分子功能)238個，取前10繪制GO富集分析氣泡圖，見圖4A。其中點越大則富集基因越多，P值越小顏色越深，代表與核心藥物組合治療冠心病關(guān)系越密切。主要涉及藥物反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細胞化學(xué)應(yīng)激反應(yīng)、金屬離子反應(yīng)等生物過程。KEGG通路富集獲得172條信號通路(P<0.05)，取前30條繪制氣泡圖，見圖4B，主要涉及PI3K-Akt、IL-I7、HIF-1等通路。

圖4 核心藥物潛在靶點的GO、KEGG分析

3 討論

張仲景在東漢時期已提出胸痹之病機為“陽微陰弦”，即胸中陽氣虛衰，下焦陰寒內(nèi)盛。根據(jù)頻數(shù)分析，在2020年版《中國藥典》(一部)中成藥制劑中，用于治療胸痹的藥物多歸肝經(jīng)、心經(jīng)，且其性味多呈溫性、寒性、苦味、辛味，核心藥物中以補虛藥、活血化瘀藥居多。自古以來醫(yī)家多認為胸痹雖病位在心，而與肝臟關(guān)系密切，肝主條達，氣機不睦則心血不行，或生痰熱，或滋寒濕，故用藥不離寒溫兩端，或以溫心肺陽氣，或以清火化痰?？辔督敌幕?，辛味破陰結(jié)。從病機而言，胸痹之罹患，初以痰濁、水飲、瘀血等為因，為邪實，故以攻法；遷延日久，則見正氣虧虛，氣血陰陽俱損，宜施補法。由此觀之，中成藥治療胸痹多以扶正補虛為基本治法，兼顧活血、理氣、清熱，在此基礎(chǔ)上針對瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物加以干預(yù)?！妒備洝吩凇爸涡乇灾T方”“治猝心痛方”中運用通氣湯、桂姜丸、木香丸等來治療胸痹，觀其方具有芳香理氣、活血通竅之功[12]。通過對數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)丹參、川芎、三七、紅花、赤芍、黃芪等為核心配伍，由此可知2020年版《中國藥典》(一部)治療胸痹的中成藥制劑多以益氣活血清熱為立方之法。聚類分析得到4個藥物組合，即川芎-紅花-赤芍、丹參-黃芪-葛根-山楂、人參-麥冬、三七-冰片。從結(jié)果來看，活血、益氣、清熱、滋陰為胸痹之經(jīng)典治法，在此基礎(chǔ)上配合調(diào)脂、開竅、行氣。胸痹患者多為青老年人，嗜食肥甘厚味，疏于養(yǎng)護攝生，厚味肥甘易生痰濁，阻滯脾胃氣機，形成惡性循環(huán)，痰濁、瘀血為陰邪，性守地而不行，壅塞之處，經(jīng)絡(luò)不通，四肢九竅，無不入者[13]。人多清竅，其氣虛、血虛、陰虛、陽虛之態(tài)，常易釀生瘀血、痰濁，人之欲念繁多，最易肝氣不得疏泄，氣機失于條達，諸多病理產(chǎn)物不運，清竅不利，故常須佐以調(diào)脂、開竅、行氣之品[14]。相關(guān)研究表明，現(xiàn)代醫(yī)家治療胸痹心痛多運用活血養(yǎng)血、補益心氣、化濁祛痰之品[15]。通過藥物對病機進行推演，胸痹的病機以正氣虛衰為主，兼以瘀、熱、痰、毒?，F(xiàn)代研究表明，冠心病的發(fā)病機制與脂質(zhì)沉積、血栓形成、炎癥-纖維增生性反應(yīng)以及內(nèi)皮細胞功能障礙有關(guān)[16-19]。本文研究的核心藥物丹參、川芎、三七均為活血止血之品，而又各有側(cè)重，丹參、川芎主活血化瘀，三七化瘀止血，兼有補虛之功，恰與脂質(zhì)沉積、血栓形成的機制相合。

通過數(shù)據(jù)挖掘分析，發(fā)現(xiàn)中成藥治療胸痹以扶正補虛為主，兼以活血、理氣、清熱，然而對其作用靶點與機制不甚清楚。進一步進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，通過以“Coronary heart disease”作為關(guān)鍵詞，共篩選出77個化學(xué)成分、242個作用靶點，得到核心藥物的活性成分與疾病的交集靶點180個，核心藥物組合的關(guān)鍵靶點主要是PTGS2、ADRB2、NCOA1、RXRA、CHRM3、SCN5A，主要涉及PI3K-Akt、TNF、IL-17、HIF-1等信號通路。在PI3K-Akt通路中，又與ERK、PKCs、eNOS、Bcl-2、Caspase9等靶點具有較大聯(lián)系。研究表明，丹參含有多種生物活性成分，其中丹酚酸B、丹參酮IIA作為兩個主要成分，在心肌梗塞小鼠模型中，通過調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)及其合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthases，eNOS)的途徑發(fā)揮舒血管作用，并通過刺激MAPK/Akt磷酸化，抑制心臟肥大，減少梗死面積[20-21]。ERK、PKCs、Caspase9是PI3K通路的經(jīng)典下游分子[22]。在缺氧條件下，細胞對外界做出創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)，在一定程度上加劇缺氧及器官損害，川芎嗪作為川芎的根莖提取物具有抑制該病理過程的作用[23]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪通過激活HIF-1α/JNK/P38通路，顯著提高了缺氧相關(guān)蛋白HIF-1α、BNIP3和IGFBP3的水平，上調(diào)了Caspase9、Caspase3的表達，從而達到保護缺氧心肌細胞的作用[24]。諸多學(xué)者對丹參和三七的中藥單體及復(fù)方做出了探索，研究表明，三七總皂苷通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPK)細胞內(nèi)信號通路，調(diào)控GATA轉(zhuǎn)錄因子中多種蛋白激酶的表達，發(fā)揮促進細胞增殖與分化作用[25]。一項對三七與丹參的合方結(jié)果表明，其作用機制可能與調(diào)節(jié)體內(nèi)脂代謝相關(guān)[26]。綜上所述，中醫(yī)藥治療胸痹，具有多方位、多靶點的特點，核心藥物丹參、川芎、三七或可成為中醫(yī)藥治療胸痹的下一階段研究方向。

本研究初步探索了2020年版《中國藥典》(一部)中成藥制劑治療胸痹的組方用藥規(guī)律及相關(guān)疾病的作用靶點及通路，為新藥開發(fā)及臨床組方用藥提供了一定的借鑒意義。在探究過程中，課題組總結(jié)出本研究存在以下不足：其一，由于疾病靶點數(shù)據(jù)庫的收錄緣故，無法以中醫(yī)病證名“胸痹”作為關(guān)鍵詞進行檢索，僅能以西醫(yī)病名“Coronary heart disease”獲取疾病靶點。胸痹與冠心病之證候相似，二者卻并不完全等同，胸痹以癥狀作為病名，范圍更為寬泛，其疾病靶點理論上多于冠心病。限于目前對傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究不足，待后續(xù)數(shù)據(jù)庫完善，可進行補充。其二，由于篇幅的有限性，在關(guān)聯(lián)與聚類分析以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究部分，著重對高頻藥物以及核心藥物進行了分析，由于中藥具有多靶點、全方位作用的特點，后續(xù)亦可以對本文中非高頻藥物、非核心藥物進行相關(guān)研究，以期更好地指導(dǎo)胸痹的臨床治療。