雙邊栝樓的組織培養(yǎng)與快速繁殖

張冰冰, 葉艷英, 周勁松, 湯泳萍, 尹玉玲, 羅紹春

(江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所， 南昌 330200)

refine seedlings and transplant

雙邊栝樓(TrichosantheskirirowiiMaxim)俗名吊瓜、藥瓜、野葫蘆等，為葫蘆科栝樓屬的多年生攀緣草質(zhì)藤本植物[1]，其果實(全栝樓)、種子(栝樓籽)、果皮(栝樓皮)及根(天花粉)均可入藥[2]。栝樓具有改善心血管、祛痰止咳、抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗?jié)儭⒖咕人幚碜饔肹3]。栝樓籽風(fēng)味獨特，可食率達60%[4]，入藥或休閑食品的研發(fā)推廣，其保健作用和食用價值都得到市場的認可。近年來，栝樓在農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和助力精準(zhǔn)脫貧中發(fā)揮了巨大作用，產(chǎn)業(yè)前景廣闊。

栝樓屬雌雄異株，種子繁育后代的雌雄株比約為3∶7[4]，幼苗期雌雄株無典型性狀差異，直至開花期才能辨別且后代性狀分離嚴重，種子不宜用于繁育種苗。目前生產(chǎn)上基本采用1～2年生植株當(dāng)年生新根繁育種苗，繁殖系數(shù)低，種根易受病蟲侵害，種性退化嚴重。利用植物組織培養(yǎng)，建立栝樓無性快繁體系，可快速定向繁育出性狀優(yōu)良、基因穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)種苗，彌補種子與塊根繁育的不足，實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)栝樓的市場推廣。阮建等[5]、錢驊等[6]對其組織培養(yǎng)展開研究，但建立的體系差異較大。筆者選用數(shù)種已建立的栝樓組織體系對雙邊栝樓皖樓20號進行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)并不適用。究其原因可能與所取材料品種(材料基因型)、生長年齡或生長時期有關(guān)。因此，本研究針對已建立的栝樓組培快繁體系進行適應(yīng)性優(yōu)化，旨在為雙邊栝樓的組培快繁與工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為雙邊栝樓皖樓20號一年生塊根，2020年2月下旬種植于江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高安創(chuàng)新示范基地(115°E、28°N)。于5—7月份采集生長健壯的優(yōu)質(zhì)單株帶腋芽莖段為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1材料滅菌與接種

取新生幼嫩的栝樓枝條放入冰盒中帶回實驗室，剪去多余的葉和葉柄，洗潔精清洗浸泡20 min清除灰塵，流水沖洗約30 min，將莖段剪成上下2～3 cm帶芽小段，莖段不宜過短，無菌水沖洗3～4次，用滅菌濾紙吸干水分。于超凈臺中將其放入無菌培養(yǎng)瓶中，采用4種方式進行滅菌(表1)，最后用滅菌濾紙吸干水分，接入純MS培養(yǎng)基中，MS培養(yǎng)基添加0.1 g/L的益培靈，抑制微生物的污染。分別于第4天、第7天和第13天統(tǒng)計污染率。

表1 外植體的不同滅菌方式Table 1 Different methods of sterilization of explants

1.2.2培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

外植體各時期誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成(表2)，MS+不同種類和水平的激素+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉，pH值5.8。高壓滅菌鍋116 ℃滅菌30 min。各時期培養(yǎng)條件：專用組培室溫度為(25±1)℃，光照時長12 h/d，光照強度2 000～3 000 lx。

表2 各時期外植體組織培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基Table 2 MS medium for tissue culture of explants in each period

1.2.3接種與統(tǒng)計

獲得的無菌外植體接種至初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每處理10瓶，每瓶接種3～4個，于第3天、第5天、第7天和第20天觀察并記錄芽誘導(dǎo)情況，并于第20天計算各處理栝樓外植體的分化系數(shù)。栝樓芽點長至3～4 cm高時，分剪成帶芽莖段，轉(zhuǎn)接至不同增殖培養(yǎng)基，每處理10瓶，每瓶接種3～4個，20 d后觀察并記錄莖段的增殖情況，篩選最佳增殖培養(yǎng)基。選擇苗高3 cm以上且?guī)в?個或3個以上莖間段的無菌苗接種至生根培養(yǎng)基，每處理10瓶，每瓶接種3～4個，觀察并記錄外植體的生長狀況及生根情況，篩選最佳生根培養(yǎng)基。最后，將根系健壯組培苗瓶蓋打開，放入少許水煉苗2 d，然后洗去根部附著培養(yǎng)基，移栽至混合比為1∶1的蚯蚓土和育苗基質(zhì)的花盆中，放置光照培養(yǎng)箱中并覆蓋白色塑料薄膜，防止水分蒸發(fā)。光照設(shè)置2 400 lx、光照時長12 h/d、溫度26 ℃、濕度70%，于第4天緩苗后除去薄膜，7～10 d后，移栽至田地中。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用WPS軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。相關(guān)指標(biāo)的計算公式為：

腋芽萌發(fā)率(%)=[萌發(fā)出腋芽(成活)的外植體總數(shù)/接種外植體總數(shù)]×100%；

分化系數(shù)=誘導(dǎo)分化芽點總數(shù)/接種成活外植體初芽點總數(shù)；

平均芽點數(shù)=外植體生長總芽點數(shù)/外植體個數(shù)；

增殖系數(shù)(%)=(芽生長到可供切割或增殖的外植體數(shù)/接種時的單芽或單外植體總數(shù))×100%；

生根率(%)=(生根的無菌苗/接種的無菌苗總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌試驗

于第4天、第7天和第13天分別對每處理組外植體污染個數(shù)進行統(tǒng)計，并在第13天計算各處理的污染率(表3)。結(jié)果表明，第4天各處理污染個數(shù)較少，處理1和處理3無污染外植體，處理2和處理4有細菌污染。第7天污染外植體顯著增加，增長率在18%～53%之間，且污染外植體以真菌污染為主，在其基部或莖段有菌絲產(chǎn)生，多以白色孢子為主，個別有黑色孢子發(fā)生。第13天各處理污染率降低，處理3的污染率降到10%以下。綜合統(tǒng)計處理2總污染率最高(84%)，處理3的污染率最低(26.3%)。所以處理3(75%酒精30 s+無菌水沖洗2～3次+0.1% HgCl210 min+無菌水沖洗3～4次)對栝樓外植體的滅菌效果最好。

表3 不同滅菌方式外植體污染情況Table 3 Statistical analysis of the contamination of explants in different sterilization methods

2.2 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

將無菌外植體分別接種至1～4號培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)，第3天和第5天統(tǒng)計各培養(yǎng)基褐化外植體總數(shù)，第7天統(tǒng)計死亡和成活總數(shù)，第20天統(tǒng)計誘導(dǎo)芽總數(shù)，并計算分化倍數(shù)。結(jié)果(表4)顯示：低濃度激素組合明顯優(yōu)于高濃度組合，即褐化外植體總數(shù)依次為培養(yǎng)基1號<2號<4號<3號，死亡總數(shù)依次為2號<1號<3號<4號。第7天發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基外植體基部均膨大有愈傷產(chǎn)生，高濃度激素組合基部膨大較快且產(chǎn)生愈傷較多，此時芽點已經(jīng)伸長。第12天已經(jīng)有節(jié)間段產(chǎn)生，且葉片開始展開(圖1 A、圖1 B)。2號培養(yǎng)基芽點總數(shù)最多，為57個，4號同比高濃度激素組合芽點總數(shù)最少，為18個，分化倍數(shù)從大到小依次為2號、1號、3號、4號。因此，最佳初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2號培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)。

2.3 莖段增殖培養(yǎng)

將上述誘導(dǎo)莖段轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基，第20天隨機選擇其中3瓶的無菌株，觀察記錄莖段的增殖情況，并計算平均分化莖段數(shù)(增殖倍數(shù))和平均芽點數(shù)(表5，圖1 C)。6號培養(yǎng)基莖段增殖倍數(shù)最大(4.75)，顯著大于5號與7號培養(yǎng)基的增殖倍數(shù)，各培養(yǎng)基外植體生長狀態(tài)詳見表5。因此，栝樓最佳莖段增殖培養(yǎng)基為6號培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L)。

表5 各培養(yǎng)基莖段增殖統(tǒng)計與描述Table 5 Statistics and description of stem proliferation of each medium

2.4 無菌株生根培養(yǎng)

將無菌莖段分別轉(zhuǎn)接至8～11號生根培養(yǎng)基，觀察并記錄生根情況(表6，圖1 D、圖1 E)。第4～6天發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基無菌株基部有少量愈傷產(chǎn)生。9號培養(yǎng)基第7天栝樓苗開始生根，繼續(xù)培養(yǎng)15 d主根系變長且粗壯，伴隨有側(cè)根產(chǎn)生，第19～20天觀察根系發(fā)達，組培苗生長健壯。8號培養(yǎng)基相對9號培養(yǎng)基生根率較低，相差58%，且平均每株生根數(shù)較9號培養(yǎng)基少2～3條。9號培養(yǎng)基第7天最先生根，8號培養(yǎng)基第10天開始有根產(chǎn)生，11號培養(yǎng)基18 d以后個別外植體有根產(chǎn)生，截止第20天，10號培養(yǎng)基無菌株無根系產(chǎn)生，11號培養(yǎng)基僅2株無菌株生根，其絕大多數(shù)外植體基部膨大凸起，被愈傷包裹，無生根跡象。因此，最佳生根培養(yǎng)基為9號培養(yǎng)基(MS+ IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L)。

表6 各培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根統(tǒng)計與描述Table 6 Statistics and description of induced rooting of each medium

2.5 組培苗煉苗移栽

隨機挑選30株上述生根組培苗，煉苗移栽，截止第15天時統(tǒng)計死亡3株，組培苗清洗時因為其莖稈和根系較脆，清洗掉根死亡1株，成活率為86.7%，成活率較高。

3 結(jié)論與討論

目前外植體常用滅菌劑有75%酒精，0.3%～0.6% NaClO和0.1% HgCl2，選用何種滅菌劑和滅菌時間由外植體部位及幼嫩程度所決定。一般在徹底殺死表面微生物的同時，又要盡可能減少滅菌劑對外植體組織和表層細胞的傷害。本研究選用上述滅菌劑，采用單一滅菌劑對比交替滅菌的方式，發(fā)現(xiàn)交替滅菌效果(平均總污染率35.7%)明顯優(yōu)于單一滅菌劑的效果(平均總污染率71%)。所以，在實踐中可以采取交替滅菌和多次滅菌相結(jié)合的方式，以達到滅除雜菌的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，使用75%酒精30 s+無菌水沖洗2～3次+0.1% HgCl210 min+無菌水沖洗3～4次效果較好，污染率為26.3%。雖然0.1% HgCl2在建立外植體無菌系中起著重要作用，顯著優(yōu)于其他滅菌劑，但HgCl2附著其外植體表面，無菌水難以徹底清洗干凈，會對切口處造成損傷，增加褐化，抑制生長。因此，在初次修剪時，將莖段剪成上下2～3 cm帶芽小段，方便HgCl2滅菌后剪去切口。其次，HgCl2屬于重金屬離子廢液，對環(huán)境危害較大[7]。因此，建立效率高、危害小的滅菌體系是現(xiàn)實所需的。筆者前期采用錢驊等[6]的滅菌方法處理外植體，其除菌效果不太理想，原因可能與采樣環(huán)境、外植體狀態(tài)有關(guān)。種植基地距實驗室較遠，采樣時均碰上雨天，極大地增加了外植體污染的概率。

在植物組織培養(yǎng)中，植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)中起著重要的作用[8]。生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。如何平衡兩者種類和比例以控制植物細胞的發(fā)育方向，是組織培養(yǎng)體系建立的核心。前人研究結(jié)果均表明，6-BA在外植體芽誘導(dǎo)中具有顯著作用。如楊麗娜等[9]指出，MS+6-BA 1.5 mg/L最適合誘導(dǎo)栝蔞腋芽生長；江毅凡[10]指出，在MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L誘導(dǎo)的分化苗質(zhì)量較好；林貴美等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MS+BA 0.3 mg/L+IBA 0.06 mg/L較適合初代誘導(dǎo)的啟動培養(yǎng)。另廖華俊等[12]、曹孟德等[13]、陳惠等[14]都對其進行芽誘導(dǎo)研究，發(fā)現(xiàn)不同的體系激素水平差異較大，如BA濃度均在0.3～2.0 mg/L之間，且激素種類多圍繞BA、IBA和NAA展開。筆者前期采用上述體系對徽記2號進行無性擴繁，發(fā)現(xiàn)各體系外植體誘導(dǎo)情況不佳，第3天出現(xiàn)死亡，于接種第5天絕大部分死亡且褐化程度嚴重，僅少部分誘導(dǎo)腋芽伸長。所以筆者設(shè)置4個相對低濃度組合進行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)相同6-BA用量條件下組配NAA分化倍數(shù)2.1比IBA分化倍數(shù)1.5更適宜芽的誘導(dǎo)，且6-BA的用量增大時，其分化倍數(shù)分別為1.4和1.3，明顯抑制了芽的分化。綜上，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L。增大激素水平，根據(jù)莖段生長狀態(tài)篩選增殖培養(yǎng)基，獲得最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

IBA和NAA是誘導(dǎo)栝樓無菌株生根的關(guān)鍵激素，獲得健壯根系吸收水分與養(yǎng)分，是最后移栽成活的關(guān)鍵。林貴美等[11]誘導(dǎo)生根為MS+IBA 0.3～0.5 mg/L，楊曉伶等[4]建立生根培養(yǎng)基MS+NAA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L，錢驊等[6]誘導(dǎo)生根以MS+IBA 0.1 mg/L最好，其次是MS+NAA 0.1 mg/L。余慧琳等[15]、鄭明福等[16]、韓琳娜等[17]對栝樓組培苗誘導(dǎo)生根都進行了相應(yīng)研究，其激素水平絕大部分在0.5 mg/L及以下。筆者對上述部分體系進行生根誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)材料的差異造成體系的不通用性，第25天統(tǒng)計各培養(yǎng)基生根率在8%以下，生根率極低，部分培養(yǎng)基無根系產(chǎn)生。所以筆者針對本皖樓20號增加了各激素的水平，設(shè)置4個組合對其生根進行誘導(dǎo)。發(fā)現(xiàn)IBA和NAA組合使用時誘導(dǎo)生根率高，當(dāng)NAA與IBA水平同為0.6 mg/L時(MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L)，其根系發(fā)生快且健壯，移栽成活率高。

本研究初步建立了雙邊栝樓的組織培養(yǎng)快速繁殖體系，解決了已建立的栝樓組織培養(yǎng)體系對雙邊栝樓的不適用性，為雙邊栝樓的組培快繁與工廠化規(guī)范生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，也可為栝樓屬植物快速繁殖提供技術(shù)參考。