雜交野大麥新品系SSR與ISSR分子標(biāo)記分析

呂玉茹， 李造哲,2， 云 嵐,3

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院， 呼和浩特 010011；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草種質(zhì)創(chuàng)新與育種研究所， 呼和浩特 010011；3.草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

簡(jiǎn)單重復(fù)序列SSR(Simple Sequence Repeat)也稱(chēng)微衛(wèi)星，它是由1～6個(gè)堿基為基本單元構(gòu)成的重復(fù)序列，在各類(lèi)真核生物基因組的不同位置中均有分布[1]。SSR標(biāo)記擴(kuò)增的譜帶重復(fù)性好、多態(tài)性和分辨率高，已廣泛應(yīng)用于品種鑒定[2]、DNA指紋圖譜[3]及遺傳多樣性分析[4]等方面。在SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)，即ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)也稱(chēng)加錨微衛(wèi)星寡核苷酸技術(shù)[5]。ISSR標(biāo)記引物專(zhuān)一性和重復(fù)性強(qiáng)，在指紋圖譜的構(gòu)建[6]、種質(zhì)資源鑒定[7]及遺傳多樣性分析[8]等方面都有報(bào)道。

披堿草屬和野大麥都是麥類(lèi)作物的野生近緣種遺傳資源，具有麥類(lèi)作物缺乏的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗蟲(chóng)和抗病等基因，通過(guò)雜交可豐富麥類(lèi)作物的基因多樣性[9]。將野生近緣種牧草的優(yōu)良抗性基因?qū)臌滎?lèi)作物中，來(lái)提高其產(chǎn)量和抗性[10-12]。披堿草和野大麥本身是兩種具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良牧草。披堿草具有抗旱、抗風(fēng)沙和產(chǎn)草量高等特性，野大麥耐鹽堿、草質(zhì)好等特性。為了結(jié)合二者的優(yōu)良性狀，王照蘭等[13]將披堿草和野大麥進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，獲得了高度不育的披堿草和野大麥的正、反交F1代。李造哲[14]用回交法克服了雜種F1代的不育性，成功獲得(披堿草×野大麥)×野大麥和(野大麥×披堿草)×野大麥的回交一代，并進(jìn)一步培育成新品種(品系)。

為防止雜交后代形態(tài)特征不容易判定其真?zhèn)蔚膯?wèn)題，避免良種繁育過(guò)程中出現(xiàn)品種混雜現(xiàn)象，通過(guò)分子標(biāo)記快速有效地鑒定雜交野大麥新品系的真實(shí)性具有現(xiàn)實(shí)意義?；谇捌趯?duì)雜交后代不同株系的RAPD、細(xì)胞遺傳學(xué)、同工酶等方面的研究[15-17]，本研究利用ISSR、SSR分子標(biāo)記對(duì)選育的雜交野大麥新品系Y33和P13進(jìn)行鑒定，并構(gòu)建其指紋圖譜，從而為雜交野大麥新品系種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與利用提供依據(jù)。同時(shí)在DNA分子水平上比較新品系與雙親間的遺傳差異，分析SSR和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在披堿草和野大麥遠(yuǎn)緣雜種鑒定及遺傳育種上應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)、野大麥(HordeumbrevisubulatumLink.)、Y33((野大麥×披堿草)×野大麥回交選育的新品系)、P13((披堿草×野大麥)×野大麥回交選育的新品系)。試驗(yàn)用ISSR[1]和SSR[19]標(biāo)記引物(表1、表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 ISSR標(biāo)記引物信息Table 1 Primer information of ISSR marker

表2 SSR標(biāo)記引物信息Table 2 Primer information of SSR marker

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA提取及檢測(cè)

對(duì)4種試驗(yàn)材料分別摘取25個(gè)單株嫩葉，采用北京天根公司的植物基因組試劑盒提取基因組DNA。用微量核酸蛋白分析儀、1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA濃度、純度及質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。將4種材料的25個(gè)基因組DNA分別等量混合，混合后根據(jù)用量稀釋至30 ng/μL并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，剩余部分置?20 ℃冰箱保存。

1.2.2PCR擴(kuò)增及電泳

ISSR標(biāo)記：PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積20 μL，包括DNA模板1 μL (30 ng/μL)，引物1 μL (10 μmol/L)，PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min (預(yù)變性)；94 ℃ 30 s(變性)，50 ℃ 45 s(依據(jù)引物的退火溫度)，72 ℃ 1 min(延伸)，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，每個(gè)樣品點(diǎn)樣6 μL，以DL 3000 Marker(北京天根公司)為對(duì)照。在電泳儀上恒壓180 V預(yù)電泳30 min后在恒壓200 V下電泳50 min，凝膠用UVP紫外凝膠成像儀照相保存。

SSR標(biāo)記：PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積20 μL，其中有DNA模板1 μL (30 ng/μL)，上下引物各1 μL (10 μmol/L)，PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min(預(yù)變性)；94 ℃ 30 s(變性)，50 ℃ 45 s(依據(jù)引物的退火溫度)，72 ℃ 30 s(延伸)，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，每個(gè)樣品點(diǎn)樣6 μL，以DL 3000 Marker(北京天根公司)為對(duì)照。在電泳儀上恒壓180 V預(yù)電泳30 min后在恒壓200 V下電泳90 min。凝膠用染色液(10%乙醇、0.5%乙酸和0.2%AgNO3)染色5 min，顯影液(3% NaOH和0.5%甲醛)顯影至條帶清晰，用掃描儀拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel軟件建立0、1數(shù)字統(tǒng)計(jì)表，有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增譜帶。多態(tài)信息含量由公式PIC求得2Pi×(1-Pi)，Pi表示第i條譜帶出現(xiàn)的頻率。用Ntsys 2.10軟件，計(jì)算遺傳相似性系數(shù)，并用類(lèi)平均法聚類(lèi)分析構(gòu)建聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的純度檢測(cè)

利用天根基因組試劑盒提取的親本和雜交新品系基因組DNA，電泳條帶清晰，基因組DNA純度較高，可用于標(biāo)記分析(圖1)。

注：P為披堿草；Y為野大麥。下同。圖1 基因組DNA純度檢測(cè)Fig.1 Genomic DNA purity test

2.2 ISSR標(biāo)記結(jié)果分析

2.2.1引物多態(tài)信息

從22個(gè)ISSR引物中篩選出12個(gè)條帶清晰且重復(fù)性較好的引物，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。每個(gè)引物可平均擴(kuò)增出5.33個(gè)總條帶和4個(gè)多態(tài)性條帶；多態(tài)比率在50.00%～100.00%之間，平均多態(tài)比率達(dá)77.93%，其中UBC 807、UBC 808、UBC 848、UBC 857擴(kuò)增出條帶的多態(tài)比率為100.00%；多態(tài)信息含量的變化幅度在0.187 5～0.375 0之間。

表3 12個(gè)ISSR標(biāo)記引物多態(tài)信息Table 3 Polymorphic information of 12 ISSR marker primers

2.2.2遺傳相似系數(shù)及聚類(lèi)圖

表4為ISSR標(biāo)記親本與雜交新品系間的遺傳差異分析。兩個(gè)親本間遺傳相似系數(shù)為0.312 5，遺傳差異較大；披堿草與兩個(gè)雜交新品系間的遺傳相似系數(shù)分別為0.359 4和0.406 3，野大麥與兩個(gè)雜交新品系間的遺傳相似系數(shù)分別為0.921 9和0.812 5，說(shuō)明雜交新品系Y33和P13偏向輪回親本野大麥遺傳；雜交新品系間的遺傳相似系數(shù)為0.828 1，新品系間遺傳較為相似。聚類(lèi)分析(圖2)在遺傳距離0.80處，新品系Y33和P13與親本野大麥聚為一類(lèi)，披堿草為一類(lèi)；而在0.92處，新品系Y33和野大麥聚為一類(lèi)。

注：C 1～C 4依次為披堿草、野大麥、Y33、P13。下同。圖2 ISSR標(biāo)記雜交野大麥新品系的聚類(lèi)Fig.2 Cluster diagram of new hybrid H. brevisubulatum lines labeled by ISSR marker

表4 ISSR標(biāo)記材料間遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients among ISSR marker materials

2.2.3指紋圖譜

從ISSR標(biāo)記篩選的多態(tài)性引物擴(kuò)增的電泳圖中，選擇4個(gè)有代表性的引物UBC 811、UBC 822、UBC 845和UBC 856構(gòu)建DNA指紋圖譜(表5)，引物UBC 811(圖3)在1 000 bp處，只有披堿草無(wú)條帶，可將披堿草區(qū)別出；在700 bp處，野大麥和Y33有條帶，在440 bp處，只有Y33有條帶，可將野大麥和Y33區(qū)別出；在490 bp處，披堿草和Y33有條帶，而P13在700 bp、490 bp和440 bp三個(gè)片段中都無(wú)條帶，可將P13區(qū)別出。引物UBC 811能將4種材料彼此區(qū)分開(kāi)。引物UBC 811的440 bp、UBC 822的1 450 bp、UBC 845的2 700 bp和UBC 845的1 200 bp可直接區(qū)別出Y33、披堿草、P13和野大麥。表5中不同引物的不同片段相互組合都可將4種材料區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，ISSR標(biāo)記有較強(qiáng)的品種鑒別能力。

注：M為DL 3000。下同。圖3 ISSR標(biāo)記引物UBC 811對(duì)雜交野大麥新品系的擴(kuò)增Fig.3 Amplification map of new hybrid H. brevisubulatum lines by ISSR marker primer UBC 811

表5 雜交野大麥新品系ISSR標(biāo)記指紋圖譜Table 5 ISSR marker fingerprints of new hybrid H. brevisubulatum lines

2.3 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

2.3.1引物多態(tài)信息

6對(duì)SSR引物檢測(cè)結(jié)果表明(表6)，平均條帶總數(shù)為13.33，引物GST 37(圖4)擴(kuò)增出的條帶最多(23條)，平均多態(tài)條帶為8.83，GST 25擴(kuò)增的多態(tài)條帶最多(15條)；多態(tài)比率的范圍為55.56%～100.00%，平均多態(tài)比率為69.22%，GST 127的多態(tài)比最高(100%)；多態(tài)信息含量從0.208 3到0.390 6不等，平均為0.274 5，多態(tài)信息含量最高是引物GST 127(0.390 6)。

表6 6對(duì)SSR標(biāo)記引物多態(tài)信息Table 6 Polymorphic information of 6 pairs of SSR marker primers

圖4 SSR標(biāo)記引物GST 37對(duì)雜交野大麥新品系的擴(kuò)增 Fig.4 Amplification map of new hybrid H. brevisubulatum lines by SSR marker primer GST 37

2.3.2指紋圖譜

從SSR標(biāo)記的6對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增的電泳圖中篩選出3對(duì)有代表性的引物(GST 37、GST 1、GST 99)構(gòu)建DNA指紋圖譜(表7)。引物GST 37(圖4)，在268 bp處，只有披堿草無(wú)條帶，可將披堿草區(qū)分出；232 bp處，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)親本有條帶，可將野大麥區(qū)分出；在100 bp處，只有P13有條帶，可將P13區(qū)分出；118 bp處，野大麥和P13有條帶，而Y33在232 bp、118 bp、100 bp處均無(wú)條帶，可將Y33區(qū)分出。引物GST 37能夠鑒別出親本和雜交野大麥新品系。引物GST 37的100 bp、GST 1的50 bp、GST 99的298 bp和GST 99的120 bp可直接區(qū)別出P13、Y33、披堿草和野大麥。表7中不同引物的不同片段相互組合都可將4種材料區(qū)別開(kāi)來(lái)。因此，SSR標(biāo)記可作為鑒別親本和雜交品種的有力工具。

表7 雜交野大麥新品系SSR標(biāo)記指紋圖譜Table 7 SSR marker fingerprints of new hybrid H. brevisubulatum lines

2.3.3遺傳相似系數(shù)及聚類(lèi)圖

據(jù)表8分析可知，兩個(gè)親本間的遺傳相似系數(shù)為0.512 5；兩個(gè)雜交新品系與披堿草的遺傳相似系數(shù)分別為0.500 0和0.550 0，與野大麥的遺傳相似系數(shù)分別為0.712 5和0.762 5，表明雜交新品系Y33和P13偏向輪回親本野大麥遺傳；兩個(gè)雜交新品系間的遺傳相似系數(shù)為0.850 0，說(shuō)明在這幾個(gè)位點(diǎn)上新品系間更為相似。從圖5可看出，在遺傳距離0.73處，新品系Y33和P13與親本野大麥聚為一類(lèi)，披堿草為一類(lèi)；0.85處，兩個(gè)新品系聚為一類(lèi)。

表8 SSR標(biāo)記材料間遺傳相似系數(shù)Table 8 Genetic similarity coefficients among SSR marker materials

圖5 SSR標(biāo)記雜交野大麥新品系的聚類(lèi)Fig.5 Cluster diagram of new hybrid H. brevisubulatum lines labeled by SSR marker

3 討論與結(jié)論

DNA指紋圖譜是鑒別生物個(gè)體之間差異的一種電泳圖譜，其操作速度快、多態(tài)性豐富、特異性高、較穩(wěn)定，是鑒別品種、品系(含雜交親本、自交系)的有效方法[20]。郭海林等[21]用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了11個(gè)結(jié)縷草屬優(yōu)良品系的指紋圖譜。該技術(shù)也可用于辨別雜種后代的真假性[22]。ISSR標(biāo)記在建立指紋圖譜方面也有報(bào)道[23]。李永祥等[18]分析了ISSR和SSR標(biāo)記在披堿草屬植物研究中的可行性，表明兩種標(biāo)記都可將屬內(nèi)的四倍體種和六倍體種區(qū)分開(kāi)，在披堿草屬植物種間分析是有效的，且不同標(biāo)記有不同的多態(tài)性檢測(cè)范圍。本研究參考了鑒定披堿草屬植物的兩種標(biāo)記引物，篩選出重復(fù)性好、條帶清晰的12個(gè)ISSR標(biāo)記引物和6對(duì)SSR標(biāo)記引物的平均多態(tài)性位點(diǎn)百分率分別為77.93%和69.22%，兩種標(biāo)記的不同引物不同片段相互組合可鑒別出雜交新品系與親本，重復(fù)檢測(cè)出的特異性條帶亮度較輕，說(shuō)明還需要篩選更多的適合鑒定遠(yuǎn)緣雜交品種的引物。試驗(yàn)采用的品種數(shù)量也較少，對(duì)引物的有效性還有待在更多的品種上驗(yàn)證。若構(gòu)建高樣本量的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，供試品種也需要采集更多的位點(diǎn)，以完善指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

用ISSR和SSR標(biāo)記方法對(duì)苜蓿屬(Medicago)及其近緣植物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ISSR標(biāo)記有更多的多態(tài)性位點(diǎn)，兩種方法的聚類(lèi)結(jié)果雖不完全相同，但都能區(qū)分出類(lèi)群，結(jié)果表明，兩種標(biāo)記都可有效區(qū)分苜蓿屬及其近緣植物的親緣關(guān)系[24]。本研究的新品系Y33和P13是由披堿草屬和大麥屬植物進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交并多年選育獲得的，在兩種標(biāo)記的引物擴(kuò)增圖中也可看出，兩個(gè)雜交新品系對(duì)親本的DNA有繼承也有缺失，還有自己特異的遺傳信息。兩種標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)均顯示，Y33、P13與野大麥的遺傳相似系數(shù)高于披堿草。ISSR標(biāo)記中Y33與野大麥聚為一類(lèi)，SSR標(biāo)記中Y33和P13聚為一類(lèi)，但兩種標(biāo)記的Y33和P13都與親本野大麥聚為一類(lèi)，表明新品系Y33和P13偏向輪回親本野大麥遺傳，這與李造哲等[15]對(duì)披堿草和野大麥及其雜種F1代與BC1代RAPD分析的結(jié)果一致，雜種后代偏向輪回親本遺傳。ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)老芒麥(Elymussibiricus)和紫芒披堿草(Elymuspurpuraristatus)及其雜種F1代與BC1代的遺傳差異分析也表明，BC1代偏向輪回親本老芒麥遺傳[25]。

綜上所述，兩種標(biāo)記方法的研究結(jié)果一致，在遠(yuǎn)緣雜交野大麥種質(zhì)資源鑒定研究中是有效的，但兩種標(biāo)記結(jié)果在品種鑒定和產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面的作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。經(jīng)ISSR、SSR標(biāo)記分析，雜交新品系偏向輪回親本野大麥遺傳；兩種標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜都能客觀真實(shí)地檢測(cè)出親本與雜交后代間的遺傳差異，可用于遠(yuǎn)緣雜種鑒定。引物UBC 811和GST 37可準(zhǔn)確鑒別親本與雜交野大麥新品系，可以在構(gòu)建雜交野大麥品種指紋數(shù)據(jù)庫(kù)中推薦使用。