西瓜枯萎病尖孢鐮孢菌生理小種3 初報

王 冠，李小妮，楊萬邦，薛麗芳，張興平，李建設(shè)，鄧 云

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 銀川 750021； 2.北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院 山東 濰坊 261000；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院園藝研究所 銀川 750002）

西瓜（L.）是一種重要的經(jīng)濟作物，在全世界廣泛種植，中國是世界上最大的西瓜生產(chǎn)與消費國。枯萎病是西瓜的主要病害之一，給西瓜生產(chǎn)造成嚴重損失。尖孢鐮孢菌西瓜專化型（f. sp.，F(xiàn)ON）是西瓜枯萎病的主要致病菌，存在明顯的種內(nèi)分化，根據(jù)其對不同抗病品種的致病力，劃分為4 個生理小種，分別是生理小種0、1、2 和3。

寧夏回族自治區(qū)是我國著名的壓砂西瓜和夏季西瓜產(chǎn)區(qū)，由于長期的連作，該地區(qū)西瓜枯萎病發(fā)病日益嚴重，然而寧夏地區(qū)西瓜枯萎病致病病原菌鑒定未見研究報道。迄今為止，國內(nèi)報道了4 個生理小種中的3 個，分別為小種0、1 和2，生理小種3 尚未見報道。其中生理小種0 在河北、武漢和安徽被報道。生理小種1 在中國是優(yōu)勢小種，已在河北、湖北、新疆、黑龍江、山東和北京被報道。而生理小種2 僅在河北被報道。Zhou 等首次報道了在美國馬里蘭州引起PI 296341-FR 枯萎病發(fā)病率高于78%的病原菌，并將其鑒定為新的生理小種，即生理小種3。

2021 年筆者在寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村金城5 號商品西瓜生產(chǎn)基地觀察到典型的枯萎病病株，該品種高抗枯萎病生理小種1。為了明確該病害的病原種類，筆者采集典型發(fā)病植株進行病原菌分離純化，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進行病原菌鑒定，并利用西瓜鑒別寄主接種進行生理小種鑒定，為進一步防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試病樣：2021 年7 月從寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村商品西瓜生產(chǎn)基地采集具有典型發(fā)病癥狀的西瓜植株。西瓜品種為金城5 號（由中衛(wèi)市金城種業(yè)有限責(zé)任公司選育），高抗枯萎病生理小種1。鑒別寄主：Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR，由國家西甜瓜種質(zhì)資源中期庫友情提供。對照菌株：尖孢鐮孢菌西瓜?；蜕硇》N2（NXWFW011），與供試病樣分離自同一地塊，經(jīng)鑒別寄主鑒定為生理小種2。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化 將采集到的發(fā)病植株沿莖基部剪下，用清水清洗干凈后，將樣品置于75%酒精中浸泡30 s，然后用無菌水沖洗3 次，滅菌濾紙吸干表面水分后，從病健交界處切取30 mm的小塊組織，接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上26 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，選擇形態(tài)與鐮孢菌相似的菌落，將分離菌株單孢純化后轉(zhuǎn)入PDA 培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌致病性鑒定 2021 年10—11 月在山東省濰坊市北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院作物育種平臺采用柯赫氏法則對分離菌株進行致病性驗證。采用浸根法接種，將處于子葉展平期的Black Diamond 西瓜苗根系漂洗干凈后，在6×10個孢子·mL的孢子懸浮液中浸根30 s，隨后采用隨機區(qū)組方法栽種于32 孔穴盤中，基質(zhì)經(jīng)滅菌處理，在人工氣候室中培養(yǎng)，溫度26°C/22°C（日/夜），光照14 h/10 h（日/夜），相對濕度60%，以清水接種的幼苗作為對照，每個處理接種6 株，3 次重復(fù)。接種后的28 d內(nèi)，持續(xù)觀察幼苗發(fā)病情況以確認分離菌株的致病性。

1.2.3 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化好的病原菌接種至PDA 平板上，26 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)；在100 倍倒置顯微鏡下直接觀察小型分生孢子的產(chǎn)生方式并拍照。然后依據(jù)相關(guān)分類方法進行種類鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB 法提取 病 原 菌 基 因 組DNA，PCR 擴 增-區(qū) 序列。反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL、10 μmol·L上下游引物各2 μL、2×Plus PCR MasterMix（北京瑞博興科生物技術(shù)有限公司）25 μL，加ddHO 至50 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性90 s，92 ℃變性30 s，55 ℃退火90 s，72 ℃延伸90 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min，4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司測序。將得到的序列在NCBI 中進行BLAST 比對，初步明確病原菌種類。

1.2.5 病原菌生理小種鑒定 2021 年11 月中旬至12 月底利用4 個西瓜鑒別寄主Black Diamond、Crimson Sweet、Calhoun Gray 和PI 296341-FR 在北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院人工氣候室中鑒定病原菌的生理小種。將分離菌株的孢子懸浮液濃度調(diào)整至6×10個孢子·mL，用同樣的方法接種西瓜鑒別寄主，采用隨機區(qū)組方法以清水和生理小種2 菌株接種作為對照，每個處理接種12 株，3 次重復(fù)，用滅菌基質(zhì)栽種于32 孔穴盤內(nèi)。接種后培養(yǎng)條件同上，在接種后的28 d 內(nèi)持續(xù)觀察發(fā)病情況。根據(jù)分離菌株對鑒別寄主的致病反應(yīng)，鑒定其生理小種。

1.2.6 病情分級標準及數(shù)據(jù)統(tǒng)計 統(tǒng)計時將西瓜枯萎病劃分為7 個等級，0 級：無感染癥狀；1 級：子葉邊緣黃化，生長正常；3 級：子葉枯萎，生長發(fā)育變緩；5 級：植株失水，表現(xiàn)出枯萎癥狀；7 級：整株枯萎死亡，根據(jù)發(fā)病級數(shù)，對鑒別寄主的單株進行表型判斷，0～3 級為抗病，5～7 級為感病。植株發(fā)病率=（感病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%，使用Excel 2019 統(tǒng)計感病植株數(shù)量并計算發(fā)病率，利用SPSS 26 對發(fā)病率進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

由圖1 可以看出，在發(fā)病地塊，西瓜感病植株呈簇狀或“熱點”分布，植株枯萎死亡。感病植株根系變成深褐色，根系逐漸壞死，無新生根系，維管束變褐。

圖1 西瓜枯萎病田間癥狀

2.2 病原菌形態(tài)特征

由圖2 可以看出，經(jīng)分離純化后，獲得1 個純化菌株（NXWFW008）。菌株NXWFW008 在PDA培養(yǎng)基上形成圓形菌落，氣生菌絲生長旺盛纏繞成束，菌落邊緣整齊，氣生菌絲呈絲絨狀，白色至淡粉色，培養(yǎng)基背面淡粉色；小型分生孢子數(shù)量多，橢圓形，卵形或腎形，0～1 隔，以無隔為主，大小為（5.0～10.0）μm×（1.0～3.0）μm；大型分生孢子鐮刀型，數(shù)量較少，孢子細而彎曲，兩端均勻變尖，足胞明顯，多為3～5 隔，大小為（20.0～36.0）μm×（3.0～5.0）μm；產(chǎn)孢細胞在氣生菌絲上側(cè)生的分生孢子梗上形成，有稀疏分枝，單瓶梗，安瓿瓶形，較短，為典型的尖孢鐮孢菌特征。

圖2 病原菌鏡檢

2.3 分離菌株的致病性

由圖3 可以看出，接種菌株NXWFW008 導(dǎo)致西瓜感病品種Black Diamond 呈典型的枯萎病癥狀，接種7 d 后植株表現(xiàn)葉片輕度失水萎蔫，隨后癥狀進一步發(fā)展，西瓜整株萎蔫，根及莖基部壞死致整株死亡（圖3-b），與田間癥狀相同（圖1-b）。接種清水對照植株沒有任何枯萎癥狀（圖3-a）。且從發(fā)病植株中重新分離出了接種菌株，菌落形態(tài)與NXWFW008 一致，表明分離菌株NXWFW008 是西瓜枯萎病的致病菌。

圖3 致病性檢測

2.4 EF-1α基因序列分析

菌株NXWFW008 的-基因序列比對分析結(jié)果表明，NXWFW008 與Genbank 序列登記號為 MZ773247.1、MZ773246.1、MW505885.1 和MW315889.1 的參考菌株序列同源性均達99.7%，且依據(jù)最大似然法（ML）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也顯示，菌株NXWFW008 與上述參考菌株聚為一支，自舉支持率為100%，遺傳關(guān)系近（圖4）。因此，鑒定分離菌株NXWFW008 為f.sp.。

圖4 基于EF-1α 序列構(gòu)建的ML 進化樹

2.5 病原菌生理小種鑒定

由表1 可以看出，4 個鑒別寄主對不同生理小種的抗感反應(yīng)，Black Diamond 感所有生理小種，Crimson Sweet 抗生理小種0，Calhoun Gray 抗生理小種0 和1，PI 296341-FR 抗生理小種0、1 和2。

接種菌株NXWFW008 后，PI 296341-FR 發(fā)病率高達93.75%，而Black Diamond、Crimson Sweet和Calhoun Gray 完全感病，發(fā)病率均為100%，不同鑒別寄主發(fā)病率無顯著差異（表1，圖5），4 個西瓜鑒別寄主均表現(xiàn)為高感病與生理小種3 抗感反應(yīng)一致。接種菌株NXWFW011 后，Black Diamond、Crimson Sweet 和Calhoun Gray100%發(fā)病死亡，而PI 296341-FR 發(fā)病率為16.65%，表現(xiàn)為高抗。與NXWFW011（race 2）相比，菌株NXWFW008 能夠侵染PI 296341-FR 且發(fā)病率高達93.75%，因此鑒定NXWFW008 為生理小種3。

圖5 不同菌株和對照接種后4 個西瓜鑒別寄主發(fā)病情況

表1 鑒別寄主對不同生理小種的抗性及寄主對菌株NXWFW008 的鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

菌株NXWFW008 的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)和鑒別寄主鑒定結(jié)果表明，分離自寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭縣金山村的西瓜枯萎病致病菌為尖孢鐮孢菌西瓜專化型生理小種3（f.sp.，race 3）。張興平利用不同抗性的西瓜品種，對國內(nèi)8 個省市的西瓜枯萎病菌分離物進行鑒定，首次證明了我國存在西瓜枯萎病生理小種分化，此后國內(nèi)陸續(xù)報道了生理小種0、1 和2，優(yōu)勢致病菌為生理小種1。生理小種3 在全球分布較少，目前僅在美國馬里蘭州、佛羅里達州和喬治亞州被報道，本研究為尖孢鐮孢菌生理小種3 侵染導(dǎo)致的西瓜枯萎病在中國的首次研究報道。

生理小種3 在寧夏地區(qū)的出現(xiàn)，可能是由長期種植抗生理小種1 的品種對病原菌形成的高選擇壓力造成的。金山村商品西瓜生產(chǎn)基地已經(jīng)連續(xù)種植超過25 年，瓜農(nóng)均選擇種植抗生理小種1的栽培品種，包括金城5 號、冠龍、瑞龍等，主栽品種為金城5 號，有研究顯示金城5 號對枯萎病生理小種2 也有較強的抗性，長期種植抗病品種會對病原菌造成額外的選擇壓力，使病原菌向致病力更強的方向進化，生理小種2（NXWFW011）和生理小種3（NXWFW008）在同一地塊中被發(fā)現(xiàn)，為生理小種3 由生理小種2 進化而來提供了額外的證據(jù)。

生理小種3 的存在對寧夏地區(qū)的西瓜生產(chǎn)構(gòu)成了新的威脅，增加了西瓜枯萎病防治的難度，目前還未見抗生理小種3 西瓜種質(zhì)的報道，長期輪作和化學(xué)熏蒸被認為是防治由生理小種3 引起的西瓜枯萎病的最佳選擇。寧夏其他地區(qū)以及全國西瓜主產(chǎn)區(qū)枯萎病優(yōu)勢致病菌是否發(fā)生演變，急需開展全面的鑒定，以制定相應(yīng)的防控措施來保障西瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。