瓜類細(xì)菌性果斑病國外研究新進(jìn)展

費(fèi)諾亞，陳華民，楊玉文，關(guān) 巍，劉寶玉，趙廷昌

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 沈陽 110866； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 北京 100193；3.巴彥淖爾市現(xiàn)代農(nóng)牧事業(yè)發(fā)展中心 內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

瓜類細(xì)菌性果斑?。˙acterial fruit blotch，BFB）是由西瓜噬酸菌（）引發(fā)的高危種傳細(xì)菌性病害，自1965 年首次在美國報(bào)道以來，不斷向其他地區(qū)和國家擴(kuò)散與傳播，近幾年在法國的瓜德羅普島、北馬其頓共和國等又有新的發(fā)現(xiàn)與報(bào)道，此外，關(guān)于西瓜噬酸菌新寄主番茄和茄子的報(bào)道也非常值得關(guān)注。西瓜感染該病原菌后，通常子葉葉緣出現(xiàn)水漬狀病斑并沿葉脈發(fā)展，斑點(diǎn)周圍有黃色暈圈。因其發(fā)生重、危害廣、防治難等特點(diǎn)，多年來科研工作者們對西瓜噬酸菌（.）開展了大量研究。筆者對近5 年國外西瓜噬酸菌（.）的主要研究與報(bào)道進(jìn)行了梳理，有助于制定科學(xué)有效的瓜類細(xì)菌性果斑病防治策略，并且可在一定程度上探明今后的研究方向。

1 西瓜噬酸菌種內(nèi)分化

西瓜噬酸菌于2008 年正式被確立為一個(gè)獨(dú)立的種，為變形菌門β-變形菌綱噬酸菌屬的一個(gè)種。其種內(nèi)可分為3 個(gè)亞組，在致病性方面，I 組菌株大多數(shù)分離自葫蘆科的非西瓜寄主，對葫蘆科中的幾種寄主具有中等致病性或強(qiáng)致病性；而Ⅱ組菌株大多數(shù)分離自西瓜，對西瓜致病性強(qiáng)，但對葫蘆科非西瓜寄主致病力弱，且I 組和II 組西瓜噬酸菌無論是在田間自然發(fā)病還是人工接種時(shí)都有明顯的西瓜和甜瓜寄主偏好，尤其是在果實(shí)組織中更明顯；Ⅲ組為一組弱致病性的菌株，最初發(fā)現(xiàn)于印度。I 組和Ⅱ組均已有代表菌株基因組數(shù)據(jù)上傳至NCBI，在最近的研究中，Yang 等重新組裝了I組菌株M6 的基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)天然存在的質(zhì)粒pACM6，而在Ⅱ型菌株目前未發(fā)現(xiàn)有類似的質(zhì)粒存在。

2 西瓜噬酸菌的檢測

種子傳播是BFB 的重要傳播途徑，因此，種子檢疫與病原菌檢測技術(shù)在控制病害中起著重要作用。目前，應(yīng)用較多的檢測技術(shù)多基于PCR 或血清學(xué)方法。

2.1 PCR檢測

PCR 是檢測病原菌中最常用的檢測方法之一，在西瓜噬酸菌中有報(bào)道的PCR 檢測方法包括傳統(tǒng)PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）以及交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增（cross-priming amplification，CPA）等。與其他檢測方法相比，普通PCR 檢測是較快的檢測方式，qRT-PCR 則是人工成本較低的方法，且假陽性概率非常低。近年來，新的引物與PCR 檢測體系不斷被開發(fā)，Slovareva 與Starikova基于編碼PAS 結(jié)構(gòu)域（Per-周期晝夜蛋白-Arnt-芳基烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-Sim-專一蛋白結(jié)構(gòu)域）S-box 蛋白的序列，開發(fā)了一種新的鑒定西瓜噬酸菌的qPCR 檢測引物PAS F/R 與鑒定方法；Shneider 等基于富亮氨酸重復(fù)核糖核酸抑制酶基因（Leucine-rich repeat ribonuclease inhibitor）設(shè)計(jì)并應(yīng)用了新的引物AC-1 F/R 對西瓜噬酸菌進(jìn)行檢測。PCR 檢測還可用于區(qū)分西瓜噬酸菌的不同亞組，Zhao 等利用不同組的特異性檢測引物，建立了雙重PCR 體系用于檢測樣品中I 組和Ⅱ組西瓜噬酸菌的分布情況。

2.2 血清學(xué)檢測

基于免疫反應(yīng)的檢測方法在西瓜噬酸菌上的應(yīng)用也有報(bào)道，但傳統(tǒng)免疫學(xué)方法在靈敏度與準(zhǔn)確度方面有一定欠缺，在現(xiàn)代成像技術(shù)的加持下，免疫學(xué)檢測技術(shù)的靈敏度與準(zhǔn)確性被不斷推上新的峰值。側(cè)向流動(dòng)免疫分析（lateral flow immunoassays，LFA）快速檢測試劑盒可以提供半定量結(jié)果，提高可重復(fù)性，并減少誤差。Saisin 等通過手動(dòng)優(yōu)化圖像采集設(shè)備的參數(shù)，如相機(jī)曝光時(shí)間等，與自動(dòng)模式設(shè)置相比，將西瓜噬酸菌LFA 的檢測限和靈敏度分別提高了3 倍和5 倍。

2.3 拉曼高光譜成像檢測

除上述常見的檢測方法外，研究人員也對其他一些檢測方法進(jìn)行了嘗試，Hoonsoo 等認(rèn)為拉曼高光譜成像技術(shù)在檢測西瓜噬酸菌種子帶菌方面具有較大的潛力，利用400～1800 cm范圍內(nèi)的拉曼高光譜成像數(shù)據(jù)，分析確定1 076.8 cm和437 cm處的2 條譜帶可作為區(qū)分病菌感染種子和健康種子的最佳拉曼峰，具有快速、準(zhǔn)確和非破壞性的優(yōu)點(diǎn)。

3 西瓜噬酸菌的致病機(jī)制

雖然瓜類細(xì)菌性果斑病目前危害嚴(yán)重，但對致病菌致病機(jī)制的研究尚未形成完善的網(wǎng)絡(luò)。深入了解西瓜噬酸菌致病過程，解析其致病機(jī)制，是研發(fā)靶向制劑及制定針對性防治策略的重要基礎(chǔ)，也是防治果斑病的必由之路。近年來，國外對西瓜噬酸菌致病機(jī)制的研究主要集中在三型分泌系統(tǒng)、菌毛等關(guān)鍵致病因子方面。

目前，已經(jīng)證明西瓜噬酸菌的三型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）是其關(guān)鍵致病因子，但其天然寄主西瓜由于遺傳操作困難，在寄主與T3SS 的互作研究中，很難應(yīng)用西瓜作為互作對象，嚴(yán)重限制了西瓜噬酸菌T3SS 的進(jìn)一步研究。但隨著煙草（species）被證明可作為西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用機(jī)制，T3SS 效應(yīng)蛋白（T3SS effectors，T3Es）及其作用靶標(biāo)逐漸被發(fā)掘。基于AraC 型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HrpX 對T3Es 編碼基因的調(diào)控以及生物信息分析，Jiménez-Guerrero 等初步篩選到了7 個(gè)候選T3Es。2018 年，Rosenberg 等發(fā)現(xiàn)功能型Ⅳ菌毛（Type Ⅳpilus，T4P）是西瓜噬酸菌致病的重要因素之一，通過T4P 轉(zhuǎn)座子突變體文庫鑒定了多個(gè)突變體的表型，并對T4P 相關(guān)基因功能進(jìn)行了研究，所有突變體均在定殖能力、致病能力及生物膜形成能力等方面弱于野生型M6。Kim 等證實(shí)了.中一個(gè)假定的雙功能分支酸變位酶/預(yù)苯酸脫水酶CmpAc 和假定的Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase（GlpdAc）均與西瓜噬酸菌的毒力相關(guān)，且證明了GlpdAc 參與甘油代謝等。

4 瓜類細(xì)菌性果斑病的防治方法

現(xiàn)階段，瓜類細(xì)菌性果斑病尚無商品化的、有推廣價(jià)值的抗病品種，當(dāng)前的很多抗性育種材料仍處于試驗(yàn)階段或小范圍應(yīng)用中，主要的防治方法仍是農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治與生物防治等。

4.1 農(nóng)業(yè)防治

硅肥被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)防治，含硅礦渣肥的施用使甜瓜的果斑病的病情指數(shù)顯著降低了14%，發(fā)生率降低了12%，改善了土壤肥力、植株生長和營養(yǎng)狀況，果肉厚度增加了8%，可溶性固形物含量增加了7%。同時(shí)，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)甜瓜不同雜交種之間的硅積累沒有差異。一些傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治手段經(jīng)當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)的揭示，對其有效性與作用機(jī)制都有了新的解讀。Zhao 等研究了溫度對西瓜噬酸菌定殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)在28 ℃下培養(yǎng)相比，在28 ℃下播種并在接種后3 d 后轉(zhuǎn)移到40 ℃下的種子果斑病發(fā)病率與帶菌數(shù)量均顯著降低；但溫度升高對BFB 幼苗傳播率降低的影響是可逆的，將種子從40 ℃再次轉(zhuǎn)至28 ℃培養(yǎng)，果斑病發(fā)病率重新升高；且在接種后的前3 d，西瓜噬酸菌對溫度最敏感。

4.2 化學(xué)防治

化學(xué)防治和種子處理仍是果斑病比較有效的防治方法，研究表明，利用ClO等進(jìn)行種子處理可在對種子較安全的情況下有效減少種子的帶菌量，但一些藥劑如銅離子制劑處理可造成西瓜噬酸菌進(jìn)入存活而不可培養(yǎng)狀態(tài)（VBNC），若后續(xù)條件適宜，仍有復(fù)蘇的可能。乙酸和丙酸蒸氣（100 mg·L；50 ℃；相對濕度43%或85%）處理1 h 即對西瓜噬酸菌有顯著的抑菌活性，且不會顯著影響種子的發(fā)芽率。

4.3 生物防治

針對瓜類細(xì)菌性果斑病的生物防治也有諸多研究，目前已有多種生防菌株及其代謝產(chǎn)物被證明對西瓜噬酸菌有抑制效果，熒光假單胞菌（）、枯草芽孢桿菌（）、溶磷細(xì)菌伯克氏菌（sp.）、棲稻假單胞菌（）等及異常畢赤酵母菌（）都可一定程度降低病害發(fā)生率，噬菌體也被認(rèn)為是潛在的生防材料。Rahimi-Midani 等利用從西瓜、甜瓜和南瓜中采集的樣品分離的噬菌體建立了一種潛在的BFB 生物防治方法。其研究結(jié)果表明，未經(jīng)噬菌體處理的種子接種西瓜噬酸菌后表現(xiàn)為不萌發(fā)或萌發(fā)后出現(xiàn)BFB 癥狀，相比之下，噬菌體包衣的西瓜種子在接種西瓜噬酸菌后可健康發(fā)芽的比例高達(dá)90%。另外，一些生防菌株的代謝產(chǎn)物如哈茨木霉產(chǎn)生的賴氨酸-α-氧化酶、新赤殼屬的菌株（sp.）產(chǎn)生的萘醌類物質(zhì)也對西瓜噬酸菌有抑制作用，基于比較基因組學(xué)等方法，其生防機(jī)制也逐漸清晰。但并非所有的生防菌都適用于西瓜噬酸菌，捕食性細(xì)菌蛭弧菌及其類似物（and like organisms，BALOs）會大量捕食其他細(xì)菌且殺菌譜較廣。近期研究發(fā)現(xiàn)，西瓜噬酸菌對蛭弧菌具有一定抗性，Aharon 等通過對西瓜噬酸菌菌株M6 的文庫建立與篩選，發(fā)現(xiàn)了西瓜噬酸菌編碼微小假菌毛蛋白的基因在其對噬菌蛭弧菌（）的抗性方面起重要作用，且與II 型分泌系統(tǒng)相關(guān)。

4.4 抗病育種

目前市場上仍未發(fā)現(xiàn)具有較高商業(yè)價(jià)值的瓜類細(xì)菌性果斑病抗病品種，因此抗性材料的挖掘是目前瓜類細(xì)菌性果斑病抗病育種的首要任務(wù)。雖然尚無有價(jià)值的抗性材料投入到實(shí)際生產(chǎn)中，完全免疫瓜類細(xì)菌性果斑病的種質(zhì)資源還未發(fā)現(xiàn)，但最近報(bào)道的瓜類對西瓜噬酸菌抗性相關(guān)QTL 為今后抗性品種的發(fā)掘與培育指明了方向。Islam 等通過生物測定和表達(dá)分析，鑒定了甜瓜基因組中6 個(gè)可能的抗BFB 候選R 基因。經(jīng)進(jìn)一步功能驗(yàn)證后，這些基因可以通過育種和生物技術(shù)手段靶向操縱以提高甜瓜BFB 抗性。從491 個(gè)分離的F甜瓜個(gè)體中確定了BFB 抗性的遺傳模式，這些個(gè)體由BFB抗?。≒I 353814）和感?。≒I 614596）親本雜交，F(xiàn)代均產(chǎn)生抗性，F(xiàn)代抗病和感病表型分離比例為3∶1。結(jié)果表明，BFB 抗性由1 個(gè)單基因顯性基因控制。在對57 個(gè)瓜類抗病相關(guān)基因的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，只有在抗病和感病親本之間顯示多態(tài)性的基因（編碼TIR-NBS-LRR 結(jié)構(gòu)域）被認(rèn)為是進(jìn)一步研究的良好候選基因，該基因上顯示出多個(gè)InDels和SNPs，基于感病材料的一個(gè)插入InDel 標(biāo)記設(shè)計(jì)的MB157-2，能夠在491 個(gè)F代和22 個(gè)地方品種/自交系材料中區(qū)分抗病和感病材料，檢測準(zhǔn)確率分別為98.17%和100%。這一基于PCR 的新型共顯性InDel 標(biāo)記為分子輔助育種提供了一種實(shí)用工具，旨在開發(fā)抗BFB 的甜瓜品種。Assun??o 等鑒定了在不同物候期對細(xì)菌性果斑病具有遺傳抗性的甜瓜材料，其中材料I-136 和A-43 表現(xiàn)出高水平的抗性，其果實(shí)沒有出現(xiàn)果斑病癥狀，.的種子傳播率僅為0.6%（I-136）和2.5%（A-43），可以作為果斑病抗性基因的親本供體。

4.5 綜合防治

Azman 等綜述了近年來瓜類細(xì)菌性果斑病在診斷與防治方面的研究結(jié)果，可更好地了解這種病害，提出了種子處理-清除病原-抗性品種-種子健康測定-化學(xué)防治（Seed treatment-Pathogen exclusion-Resistant cultivar-Seed health testing-Chemical control）五位一體的防控模式，為制定最有效和可持續(xù)的BFB 控制策略提供指導(dǎo)。Shirakawa 團(tuán)隊(duì)報(bào)道了該病害在日本的首次發(fā)生，并對其防控相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了研究和開發(fā)，基于已有的研究結(jié)合日本及中國瓜類的實(shí)際種植情況提出了從引種到田間栽培期間的一系列果斑病的防控措施。

5 展 望

近年來，瓜類細(xì)菌性果斑病在病原菌檢測、致病機(jī)制以及防治等方面的研究取得了很大進(jìn)展。目前，國外多名學(xué)者在進(jìn)行針對關(guān)鍵致病因子Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）的研究。相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)，T3SS 的機(jī)制研究都受限于寄主西瓜遺傳操作體系的不成熟，但隨著美國弗吉尼亞理工大學(xué)Traore 等證明模式植物煙草可作為西瓜噬酸菌的寄主并用于研究西瓜噬酸菌T3SS 在寄主中的作用機(jī)制，Ⅲ型效應(yīng)蛋白的鑒定工作方面的瓶頸正逐漸被突破，越來越多的Ⅲ型效應(yīng)蛋白陸續(xù)被報(bào)道，使得后續(xù)Ⅲ型效應(yīng)蛋白在寄主中的靶標(biāo)及相關(guān)互作研究成為可能。這也是今后西瓜噬酸菌致病機(jī)制研究的重要內(nèi)容。以色列希伯來大學(xué)的Burdman 教授團(tuán)隊(duì)，基于調(diào)節(jié)因子HrpX 對西瓜噬酸菌I組菌株M6 中的T3Es 進(jìn)行了大量的分析與預(yù)測，并在后續(xù)研究中對預(yù)測到的T3Es 進(jìn)行了鑒定等工作。美國佐治亞大學(xué)的Walcott 教授團(tuán)隊(duì)在西瓜噬酸菌的不同組的分型與鑒定方面有較多成果，包括不同組的寄主偏好、遺傳特性和分組方法等，為國內(nèi)外的其他研究者提供了大量參考。其他一些國家例如日本和韓國的學(xué)者對各類型致病因子的研究也使得西瓜噬酸菌的致病相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更加明晰，其他一些致病相關(guān)基因也豐富了人們對其致病機(jī)制的理解。國內(nèi)與國外各研究團(tuán)隊(duì)對果斑病與西瓜噬酸菌的研究各有側(cè)重，但同時(shí)也有可以互相借鑒之處，綜合各團(tuán)隊(duì)對果斑病的研究進(jìn)展，可以對果斑病有更全面的了解。雖然對西瓜噬酸菌與瓜類細(xì)菌性果斑病的研究相對于其他植物病原細(xì)菌仍比較滯后，但在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上通過不懈的努力，將能夠解開更多關(guān)于西瓜噬酸菌的謎題，并對瓜類細(xì)菌性果斑病有更全面的認(rèn)知。

由于西瓜噬酸菌以種子攜帶形式，通過種子運(yùn)輸?shù)确绞竭M(jìn)行短距離與長距離傳播，因此，對種子的檢疫工作非常艱巨且十分重要，已開發(fā)的多種檢測技術(shù)能為種子檢測提供技術(shù)支持。在病害防治方面，瓜類細(xì)菌性果斑病應(yīng)用較多的仍是化學(xué)防治，使用藥劑對種子進(jìn)行處理是目前應(yīng)用較廣且行之有效的防治方法之一，針對該病害發(fā)生的現(xiàn)狀，篩選出更多安全有效的藥劑，將對今后藥劑的輪換使用有指導(dǎo)意義。植物抗病性的利用和生物防治手段的開發(fā)是更安全的防治果斑病的手段，成為了近年來研究的熱點(diǎn)，目前，雖然已經(jīng)挖掘了部分針對西瓜噬酸菌的抗性材料與生防菌株，具有一定的應(yīng)用前景，但從試驗(yàn)到應(yīng)用仍有很長的路要走。為實(shí)現(xiàn)瓜類細(xì)菌性果斑病在生產(chǎn)上的高效防治，對果斑病菌致病機(jī)制的揭示、商品化抗性品種的篩選以及生物防治的機(jī)制等研究仍需繼續(xù)探索。