長(zhǎng)鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1聯(lián)合胃蛋白酶原對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值

王偉，鄭水平，羅琴

作者單位：荊門(mén)市中醫(yī)醫(yī)院，a脾胃一科，b肺病科，湖北 荊門(mén) 448000

胃癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，也是我國(guó)第二高發(fā)腫瘤［1］，其早期階段臨床表現(xiàn)不明顯，很難早期診斷，導(dǎo)致死亡率升高［2］。目前胃癌診斷主要方法為胃鏡檢查，但此方法花費(fèi)較大，檢查時(shí)病人較為痛苦，因此尋找替代方法十分必要［3］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（long noncoding RNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，lncRNA MALAT1）可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生［4］。有研究表明，胃癌高危人群血清中胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）水平處于異常狀態(tài)，PG 可作為癌前病變的篩查指標(biāo)［5-6］。然而目前關(guān)于lncRNA MALAT1、PG 聯(lián)合應(yīng)用于胃癌早期診斷的研究較少。因此，本研究通過(guò)探討血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平在早期胃癌中的診斷價(jià)值，以期為胃癌早期臨床診斷和及時(shí)治療開(kāi)辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017 年3 月至2019 年4 月入住荊門(mén)市中醫(yī)醫(yī)院的96例胃癌病人（病人經(jīng)胃鏡檢查和病理檢查確診，并進(jìn)行胃癌切除手術(shù)）為研究對(duì)象，最終納入其中TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人67 例（早期胃癌組），男37例，女30例；年齡范圍為44～73歲，年齡（58.64±12.38）歲；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ病人29 例（進(jìn)展期胃癌組），男16 例，女13 例；年齡范圍為44～76 歲，年齡（58.47±13.26）歲；同期選取82 例健康體檢者作為對(duì)照組，男43 例，女39 例；年齡范圍為45～74 歲，年齡（59.73±14.36）歲。三組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2010年衛(wèi)生部發(fā)布且實(shí)施的胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，且經(jīng)胃鏡及病理組織學(xué)檢查確診為胃癌者，且病人未進(jìn)行放化療等治療；②臨床資料記錄清晰者；③對(duì)照組無(wú)胃十二指腸疾病史；④無(wú)其他消化系統(tǒng)疾病者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有肝、腎、心、肺等臟器功能不全疾病及相關(guān)手術(shù)史者；②伴有感染性疾病者；③入院前一個(gè)月服用影響血清指標(biāo)檢測(cè)藥物者；④同時(shí)參與其他研究者。本研究中所有病人均由兩名及以上主治醫(yī)師明確診斷，所有受試對(duì)象均由專(zhuān)業(yè)人員詳細(xì)告知本人及近親屬研究?jī)?nèi)容并同意參加，同時(shí)簽署知情同意書(shū)。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

檢查各胃癌病人腫瘤分化、腫瘤大小、陽(yáng)性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤(rùn)、血管侵犯、TNM 分期等臨床病理參數(shù)。收集兩組一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、飲酒史、吸煙史。

1.2 主要試劑與儀器 PG I 試劑盒（貨號(hào)WL8104A），購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司；PG Ⅱ試劑盒（貨號(hào)WL8104B），購(gòu)自北京萬(wàn)泰德瑞診斷技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒（貨號(hào)R1050），購(gòu)自北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司；miScript SYBR?Green Mix（貨號(hào)218073），購(gòu)自上海齊一生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix（貨號(hào)Q111-02），購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）儀，購(gòu)自廣州市百菱生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 抽取所有研究對(duì)象清晨空腹靜脈血樣，3 000 r/min 離心15 min 后收集血清，置于-80 ℃保存待測(cè)。

1.3.2 qRT-PCR 法檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平 采用qRT-PCR 法檢測(cè)兩組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 表達(dá)水平。采用RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用qRT-PCR 儀對(duì)lncRNA MALAT1 進(jìn)行擴(kuò)增。qRTPCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA（50 μg/L）2 μL，miScript SYBR?Green Mix 10μL，正反向引物（10μmol/L）各0.8μL，ddH2O 6.4μL，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃，30 s；45個(gè)循環(huán)。lncRNA MALAT1及內(nèi)參GAPDH 的引物序列見(jiàn)表1。每份樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法對(duì)血清lncRNA MALAT1 含量進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 檢測(cè)血清中PGⅠ、PGⅡ水平 采用膠乳免疫比濁法檢測(cè)血清PG I 和PG Ⅱ水平，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s 表示，兩組間比較行t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例表示，兩組間比較行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 與PGⅠ、PGⅡ水平的相關(guān)性；ROC 診斷是否患胃癌。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較 不同腫瘤分化、腫瘤大小、陽(yáng)性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤(rùn)、血管侵犯的胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期，PGⅠ水平顯著低于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

表2 不同臨床特征胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

注：lncRNA MALAT1為長(zhǎng)鏈非編碼RNA-肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1，PGⅠ為胃蛋白酶原Ⅰ，PGⅡ?yàn)槲傅鞍酌冈颉?/p>

病理參數(shù)腫瘤分化例數(shù)MALAT1t值1.42 P值0.158 PGⅠ/（μg/L）t值1.86 P值0.066 PGⅡ/（μg/L）t值1.86 P值0.067高低31 65 109.73±15.66 115.26±18.73 36.96±7.24 39.81±6.93 11.94±3.97 13.62±4.23腫瘤長(zhǎng)徑≤4 cm＞4 cm陽(yáng)性淋巴結(jié)百分比≤9%＞9%TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ神經(jīng)浸潤(rùn)0.57 0.573 1.80 0.075 1.96 0.053 24 72 118.73±19.77 121.54±21.46 37.95±7.42 41.37±8.26 12.72±2.38 14.36±3.85 0.83 0.412 1.51 0.134 1.91 0.060 28 68 116.24±18.43 119.75±19.16 46.54±7.23 49.21±8.12 11.97±2.19 13.22±3.17 6.66 0.000 13.93 0.000 25.09 0.000 67 29 103.24±16.85 128.43±17.43 50.46±8.23 31.43±5.01 6.92±1.38 22.53±4.67 1.25 0.214 1.79 0.077 1.93 0.057有無(wú)73 23 126.57±18.32 121.21±16.54 46.84±9.73 42.79±8.57 15.34±5.46 12.84±5.27血管侵犯1.61 0.112 1.59 0.115 1.58 0.117有無(wú)74 22 119.84±14.56 114.27±13.33 39.84±7.23 36.97±8.12 19.27±6.18 16.89±6.21

2.2 三組一般資料比較 三組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒比例、吸煙比例等比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 三組一般資料比較/例

2.3 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較 進(jìn)展期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于早期胃癌組和對(duì)照組，PGⅠ水平顯著低于早期胃癌組和對(duì)照組（P＜0.05）；早期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于對(duì)照組，PG Ⅰ水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

表4 三組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較/±s

組別對(duì)照組早期胃癌組進(jìn)展期胃癌組F值P值例數(shù)82 67 29 lncRNA MALAT1 86.25±19.58 103.24±16.85 128.43±17.43 59.44＜0.001 PGⅠ/（μg/L）64.78±12.94 50.46±8.23 31.43±5.01 117.42＜0.001 PGⅡ/（μg/L）3.88±0.68 6.92±1.38 22.53±4.67 858.48＜0.001

2.4 胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 與PGⅠ、PG Ⅱ水平的相關(guān)性 胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平與PGⅡ呈正相關(guān)，與PGⅠ呈負(fù)相關(guān)（r=-0.58、0.70，均P＜0.05）。

2.5 血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值 以lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ單個(gè)指標(biāo)及三者聯(lián)合預(yù)測(cè)值為檢驗(yàn)變量繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，lncRNA MALAT1 診斷早期胃癌病人的AUC 為0.77［95%CI（0.70，0.84）］，截?cái)嘀禐?03.03，此時(shí)的特異度為89.0%，靈敏度為63.5%；PG Ⅰ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.85［95%CI（0.79，0.91）］，截?cái)嘀禐?2.63 μg/L，此時(shí)的特異度為80.5%，靈敏度為75.0%；PGⅡ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.81［95%CI（0.75，0.87）］，截?cái)嘀禐?0.36 μg/L，此時(shí)的特異度為65.9%，靈敏度為83.3%；lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合診斷早期胃癌病人的AUC 為0.89［95%CI（0.84，0.94）］，特異度為81.3%，靈敏度為85.4%。

3 討論

胃癌因早期臨床癥狀不明顯經(jīng)常導(dǎo)致錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，且影響胃癌預(yù)后，使得胃癌死亡率成為各種惡性腫瘤第3 位，對(duì)人類(lèi)健康和生命的危害較大［8］。目前胃癌大多依靠于胃鏡檢查，不僅費(fèi)用昂貴，且對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，有時(shí)難以早期確診，大多數(shù)病人確診時(shí)已處于中晚期［9］。目前臨床上用于早期胃癌檢測(cè)的其他生物標(biāo)志物靈敏度和特異度不高，因此，尋找新的、可靠的早期胃癌診斷生物標(biāo)志物已成為目前的研究熱點(diǎn)。

LncRNA 是一類(lèi)非編碼RNA 的總稱(chēng)，其長(zhǎng)度大于200 核苷酸，LncRNA 雖不編碼蛋白質(zhì)，但在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中能發(fā)揮調(diào)控作用［10］。LncRNA MALAT1 最初在非小細(xì)胞肺癌中被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物進(jìn)化中高度保守，參與許多腫瘤的發(fā)生［11］。lncRNA MALAT1 在多種腫瘤中呈高表達(dá)，如肺癌、宮頸癌、乳腺癌等，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用［12-13］。PG 分為PGⅠ和PGⅡ兩種同工酶原，是由胃黏膜分泌的胃蛋白酶前體物質(zhì)，能夠反映胃黏膜狀態(tài)的變化。PGⅠ、PGⅡ主要由胃主細(xì)胞、頸黏液細(xì)胞以及少量組織腺體合成，是參與消化的一種蛋白酶前體物質(zhì)。PG合成后僅有少量經(jīng)胃黏膜進(jìn)入血液循環(huán)，因此檢測(cè)血清PG水平的變化可判斷胃黏膜狀態(tài)［14］。劉永等［15］通過(guò)檢測(cè)、對(duì)比、分析胃癌病人和健康者血清中癌胚抗原、糖類(lèi)抗原724、lncRNA MALAT1 水平，將三者聯(lián)合用于胃癌檢測(cè)，證明其可用于胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)且具有診斷價(jià)值。本研究結(jié)果表明不同腫瘤分化、腫瘤大小、陽(yáng)性淋巴結(jié)百分比、神經(jīng)浸潤(rùn)、血管侵犯等胃癌病人血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；進(jìn)展期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平顯著高于早期胃癌組和對(duì)照組，PGⅠ水平顯著低于早期胃癌組和對(duì)照組，早期胃癌組血清中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅡ水平高于對(duì)照組，PGⅠ水平顯著低于對(duì)照組。提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ與早期、進(jìn)展期胃癌病情均密切相關(guān)，對(duì)胃癌檢出有重要提示作用，且在胃癌臨床分期中有一定的應(yīng)用價(jià)值，推測(cè)PGⅠ、PGⅡ可能通過(guò)影響胃黏膜損害而影響胃癌的進(jìn)展。本研究中l(wèi)ncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ?qū)ρ芮址浮⑸窠?jīng)浸潤(rùn)等臨床病理特征的判斷價(jià)值不高。

本研究一般資料中，對(duì)照組、早期胃癌組、進(jìn)展期胃癌組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、飲酒比例、吸煙比例等比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性，對(duì)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不產(chǎn)生影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)胃癌病人血清中l(wèi)ncRNA MALAT1 水平與PGⅡ呈正相關(guān)，與PGⅠ呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步提示血清lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ可能通過(guò)差異表達(dá)參與胃癌病情發(fā)展。lncRNA MALAT1 診斷早期胃癌病人的AUC 為0.77，截?cái)嘀禐?03.03，此時(shí)的特異度為89.0%，靈敏度為63.5%；PGⅠ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.85，截?cái)嘀禐?2.63μg/L，此時(shí)的特異度為80.5%，靈敏度為75.0%；PGⅡ診斷早期胃癌病人的AUC 為0.81，截?cái)嘀禐?0.36μg/L，此時(shí)的特異度為65.9%，靈敏度為83.3%。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ?qū)υ缙谖赴┒加幸欢ǖ脑\斷價(jià)值，且ROC曲線中PGⅠ的曲線下面積相較于其他兩個(gè)更大，診斷價(jià)值相對(duì)更高。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合診斷早期胃癌病人的AUC 為0.89，特異度為81.3%，靈敏度為85.4%。lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，早期胃癌診斷的AUC、靈敏度均顯著提高。提示lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)，提高lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ單獨(dú)使用時(shí)的靈敏度，能提高其對(duì)早期胃癌的診斷價(jià)值。

綜上所述，lncRNA MALAT1聯(lián)合PGⅠ、PGⅡ可在一定程度上檢出胃癌，為早期胃癌臨床診斷及治療提供理論依據(jù)及新思路，對(duì)降低胃癌發(fā)病率及死亡率有重要意義。提示在臨床中需密切監(jiān)測(cè)lncRNA MALAT1、PGⅠ、PGⅡ水平的變化，以提高胃癌早期診斷。但本研究為回顧性研究，有部分遺失病例，資料完整性限制了研究，且樣本數(shù)量較少、因素分析可能不夠全面，需加大樣本量進(jìn)行深入的臨床應(yīng)用研究。