微小RNA-455-3p下調(diào)TRIM27對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響

黃香春，譚雪萍，廖天志

作者單位：恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，a耳鼻喉科，b中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，湖北 恩施 445000

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是發(fā)生在鼻咽黏膜上皮的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率居耳鼻咽喉惡性腫瘤之首［1-3］。鼻咽癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，其預(yù)后較差。因此，早期診斷和治療具有重要意義。miRNA為長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性穩(wěn)定的短鏈非編碼RNA，其在人類多種疾病中均具有重要的調(diào)控作用，尤其是癌癥［4-5］。miR-455-3p 在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中均具有調(diào)控作用，但其在鼻咽癌中的作用研究甚少。含有三聯(lián)基序的27（tripartite motif 27，TRIM27）屬于三結(jié)構(gòu)域（TRIM）蛋白家族，其含有由RING 指，B 盒鋅指和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域組成的三聯(lián)基序［6-7］。它最初被鑒定為與轉(zhuǎn)染期間排列的RET（rearranged during transfection，RET）原癌基因融合伴侶，其在多種腫瘤中均出現(xiàn)表達(dá)異常升高［8-10］。據(jù)報(bào)道，TRIM27 在舌鱗癌中可被miR-299-3p 靶向負(fù)調(diào)控而參與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［11］。但TRIM27 與miR-455-3p 在鼻咽癌中的作用及機(jī)制尚未有研究。本研究自2020 年1—7 月探討miR-455-3p對(duì)5-8F細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、CNE-1 和鼻咽上皮細(xì)胞NP69 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自鄭州九龍生物制品有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司；LipofectamineTM2000 購(gòu)自北京宜科思源科技有限公司；二辛可寧酸（BCA）蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京艾然生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Roche 公司；PVDF 膜購(gòu)自日本中興化成；ECL 發(fā)光液購(gòu)自上海信帆生物科研所；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博公司。兔抗TRIM27 抗體（ab137638）和羊抗兔HRP 標(biāo)記的IgG（ab205718）購(gòu)于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 5-8F、CNE-1 和NP69 的培養(yǎng)：使用DMEM 培養(yǎng)基（15%胎牛血清）進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 正常培養(yǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、CNE-1、鼻咽上皮細(xì)胞NP69 分別標(biāo)記為NP69 組、5-8F 組、CNE-1 組。將miR-NC、miR-455-3p mimics、pcDNA3.1、pcDNA3.1- TRIM27、si-NC、si-TRIM27、miR-455-3p mimics + pcDNA3.1、miR-455-3p mimics+pcDNA3.1-TRIM27用3倍量的脂質(zhì)體來(lái)轉(zhuǎn)染，將其轉(zhuǎn)染至5-8F，轉(zhuǎn)染6 h 后，棄去培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）確認(rèn)轉(zhuǎn)染的效率如何。轉(zhuǎn)染成功后分別標(biāo)記為miR-NC 組、miR-455-3p 組、pcDNA3.1 組、pcDNA3.1-TRIM27組、si-NC 組、si-TRIM27組、miR-455-3p + pcDNA3.1 組、miR-455-3p + pcDNA3.1-TRIM27組，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中miR-455-3p、TRIM27 的mRNA 的表達(dá) 收集待檢測(cè)的細(xì)胞，用RNA抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取總RNA并合成cDNA。最后用qRT-PCR 試劑盒檢測(cè)其中miR-455-3p、TRIM27 的表達(dá)。以U6、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算miR-455-3p、TRIM27的表達(dá)。引物信息（5'-3'）：miR-455-3p 正向引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG， 反 向 引 物GCAATTCAGTTGAGCGATGTAG；TRIM27 正向引物AGCCCATGATGCTCGACTG，反向引物GGGCACGACACGTTAGTCA；GAPDH：正向引物TCC CTC AAG ATT GCT AGC AA，反向引物AGATCCACAACGGATACATT；U6 正向引物CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物AACGCTTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)細(xì)胞中TRIM27 的蛋白表達(dá) 收集待檢測(cè)的細(xì)胞，用蛋白裂解液在冰上充分裂解，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)對(duì)蛋白進(jìn)行定量，然后在沸水中煮沸10 min，進(jìn)行變性。取變性后的上清液進(jìn)行蛋白的電泳上樣。然后按照蛋白質(zhì)印跡的常規(guī)操作流程進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育、二抗孵育、顯影曝光。我們?cè)谶M(jìn)行曝光時(shí)選用的是ECL 發(fā)光試劑盒。對(duì)圖像的分析使用的是Quantity One 4.62 軟件。結(jié)果以TRIM27 條帶的灰度與GAPDH 條帶的灰度之比表示TRIM27的蛋白表達(dá)。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）檢測(cè)細(xì)胞的增殖 收集待檢測(cè)的細(xì)胞，取100 μL 的5×105濃度的細(xì)胞在96 空板上，再加入適量MTT 溶液（10∶1 的比例），培養(yǎng)4 h，再加入等量DMSO，使其充分溶解，調(diào)整酶標(biāo)儀吸光值至490 nm 波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度（A）。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡 收集待檢測(cè)的細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒要求處理細(xì)胞，依次加入Annexin V-/FITC、PI，反應(yīng)結(jié)束后立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析凋亡情況。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 采用在線靶基因預(yù)測(cè)庫(kù)target scan（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè)miR-455-3p的靶基因。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-455-3p 與TRIM27 的結(jié)合力 將野生型序列（TRIM27-WT）和突變型序列（TRIM27-MUT）克隆至PUC-T載體，并純化。同時(shí)將psiCHECK-2載體用同樣的方法進(jìn)行處理，再用點(diǎn)擊法將TRIM27-WT、TRIM27-MUT 與psiCHECK-2 載體插入感受態(tài)細(xì)胞中，最后用LB培養(yǎng)基篩選優(yōu)勢(shì)菌株，并擴(kuò)大，提取質(zhì)粒DNA，待用。將psiCHECK2-TRIM27-WT、psi-CHECK2-TRIM27-MUT 分別與miR-NC、miR-455-3p共同轉(zhuǎn)染到5-8F。按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明要求操作，將psiCHECK2-TRIM27-3'UTR WT 和psiCHECK2-TRIM27-3'UTR MUT 的表達(dá)作為對(duì)照，海腎熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值表示miR-455-3p 與TRIM27 在細(xì)胞中的結(jié)合能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均采用Graph-Pad Prism 7.0 分析處理。計(jì)量資料用±s 表示，多時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)資料比較采用重復(fù)測(cè)量方差法分析，多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)，兩組比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-455-3p 在NP69、5-8F、CNE-1 中的表達(dá)結(jié)果顯示，NP69 組、5-8F 組、CNE-1 組細(xì)胞中miR-455-3p mRNA 的表達(dá)分別為（1.37±0.06）、（0.42±0.02）、（0.96±0.05），F(xiàn) =314.35，P =0.001。與NP69組相比，5-8F組、CNE-1組細(xì)胞中miR-455-3p的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

2.2 miR-455-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)5-8F、CNE-1 增殖和凋亡的影響 結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組5-8F、CNE-1 中miR-455-3p 的表達(dá)均顯著升高［（1.58±0.11）和（0.53±0.04），（1.53±0.11）和（1.07±0.06）］，24、48、72 h時(shí)，5-8F、CNE-1細(xì)胞的活性均顯著降低［（0.41±0.02）和（0.76±0.03），（0.63±0.03）和（1.16±0.05），（1.25±0.05）和（1.86±0.11）；（0.51±0.02）和（0.74±0.03），（0.73±0.03）和（1.08±0.05），（1.25±0.05）和（1.53±0.11）］，細(xì)胞凋亡率均顯著升高［（19.06±1.26）和（7.33±0.51），（12.06±1.03）和（7.91±0.66），P＜0.05］。

2.3 miR-455-3p 靶向TRIM27 通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)顯示，miR-455-3p 與TRIM27 的3’UTR 端含7 個(gè)互補(bǔ)的核苷酸序列GUCAGGU（圖1）。與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組WT-TRIM27 細(xì)胞熒光活性顯著降低（表1）；miR-NC、miR-455-3p、antimiR-NC、anti-miR-455-3p 組TRIM27 的蛋白表達(dá)量分別為（0.66±0.04）、（0.31±0.01）、（0.70±0.05）、（1.18±0.06），miR-455-3p 在細(xì)胞中的表達(dá)量與TRIM27 的表達(dá)量之間呈明顯的負(fù)調(diào)控關(guān)系（F=196.65，P=0.001）。見圖2。

圖1 TRIM27的3’UTR中含有miR-455-3p的互補(bǔ)核苷酸序列

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

表1 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)/±s

組別miR-NC miR-455-3p t值P值重復(fù)次數(shù)33 WT-TRIM27 1.06±0.06 0.34±0.01 20.50 0.000 MUT-TRIM27 1.03±0.04 0.96±0.03 2.43 0.072

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)miR-455-3p對(duì)TRIM27表達(dá)的影響

2.4 抑制TRIM27 表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F 增殖凋亡的影響 結(jié)果如圖3；表2，3 所示，與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-TRIM27 組5-8F 細(xì)胞中TRIM27的mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著升高，與si-NC 組相比，si-TRIM27 組5-8F 細(xì)胞中TRIM27 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，在24、48、72 h 時(shí)，細(xì)胞的活性明顯下調(diào)，凋亡率明顯上調(diào)［（20.88±1.32）%比（8.03±0.41）%，t=16.10，P=0.001］；不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)間、組間×?xí)r間交互作用下的細(xì)胞活力（OD490 nm）均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TRIM27蛋白的表達(dá)

表2 TRIM27 mRNA和蛋白的表達(dá)比較/±s

表2 TRIM27 mRNA和蛋白的表達(dá)比較/±s

注：①與pcDNA3.1組比較，P＜0.05。②與si-NC組比較，P＜0.05。

組別pcDNA3.1 pcDNA3.1-TRIM27 si-NC si-TRIM27 F值P值PCNA蛋白0.72±0.03 1.31±0.06①0.75±0.03 0.11±0.01②524.42 0.001重復(fù)次數(shù)3333 PCNA mRNA 0.68±0.03 1.26±0.07①0.70±0.04 0.10±0.01②358.99 0.001

表3 抑制TRIM27對(duì)細(xì)胞5-8F增殖、凋亡的影響/±s

表3 抑制TRIM27對(duì)細(xì)胞5-8F增殖、凋亡的影響/±s

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-TRIM27組間比較，F(xiàn)，P值時(shí)間比較，F(xiàn)，P值交互比較，F(xiàn)，P值重復(fù)次數(shù)細(xì)胞活性（OD490 nm）24 h 0.55±0.03 0.34±0.02①1028.16，0.000 2394.83，0.000 624.29，0.000 33 48 h 0.86±0.03 0.45±0.03①72 h 1.44±0.10 0.62±0.03①

2.5 過(guò)表達(dá)TRIM27 部分逆轉(zhuǎn)了miR-455-3p 對(duì)5-8F 增殖和凋亡的影響 結(jié)果如表4 所示，不同組間、不同時(shí)間點(diǎn)間、組間×?xí)r間交互作用下的細(xì)胞活力（OD490 nm）均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與miR-NC 組相比，miR-455-3p 組5-8F 細(xì)胞在24、48、72 h 的細(xì)胞活性明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高［（19.06±1.26）%比（7.33±0.51）%］；與miR-455-3p +pcDNA3.1 組相比，miR-455-3p + pcDNA3.1-TRIM27組5-8F 細(xì)胞24、48、72 h 的活性顯著上調(diào)，凋亡率明顯降低［（11.13±1.01）%比（19.51±1.18）%，P＜0.05］。

表4 過(guò)表達(dá)TRIM27能夠逆轉(zhuǎn)miR-455-3p對(duì)細(xì)胞5-8F增殖的作用/±s

表4 過(guò)表達(dá)TRIM27能夠逆轉(zhuǎn)miR-455-3p對(duì)細(xì)胞5-8F增殖的作用/±s

注：①與miR-NC 組比較，P＜0.05。②與miR-455-3p+pcDNA3.1組比較，P＜0.05。

組別miR-NC miR-455-3p miR-455-3p+pcDNA3.1 miR-455-3p+pcDNA3.1-TRIM27組間比較，F(xiàn)，P值時(shí)間比較，F(xiàn)，P值交互比較，F(xiàn)，P值重復(fù)次數(shù)3333細(xì)胞活性（OD490 nm）24 h 0.76±0.03 0.41±0.02①48 h 1.16±0.05 0.63±0.03①72 h 1.86±0.11 1.25±0.05①0.43±0.02 0.66±0.04 1.28±0.06 0.62±0.03②0.91±0.06②1.55±0.12②2502.82，0.000 3437.33，0.000 15.84，0.000

3 討論

miRNA 在癌癥中的研究已成為研究的熱點(diǎn)，其通過(guò)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的阻遏而發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用［12-14］。miRNA 對(duì)腫瘤的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，其除了調(diào)控靶基因外，還可通過(guò)各種信號(hào)通路調(diào)控腫瘤的進(jìn)展［15-16］。miR-455-3p 可通過(guò)靶向HOXB5 抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［17］，還可通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白和TGF-β 信號(hào)通路減弱食管鱗癌的化療敏感性［18］，又可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和耐藥能力［19］?；ㄓ篮绲龋?0］在鼻咽癌的研究中通過(guò)miRNA 基因芯片技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-455-3p 的表達(dá)水平顯著降低，令人遺憾的是，并未進(jìn)行深入的對(duì)鼻咽癌細(xì)胞表型變化的研究。本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)了人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、CNE-1和鼻咽上皮細(xì)胞NP69中miR-455-3p的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-455-3p 在鼻咽癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，這是首次在鼻咽癌細(xì)胞中確定miR-455-3p 的低表達(dá)，與其在鼻咽癌組織中的低表達(dá)相呼應(yīng)；進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-455-3p 可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡，這是國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)miR-455-3p對(duì)鼻咽癌體外研究的細(xì)胞表型變化結(jié)果，為miR-455-3p 在鼻咽癌中的進(jìn)一步研究提供依據(jù)，也為miR-455-3p 在鼻咽癌中的體外研究奠定理論基礎(chǔ)；深入研究，證實(shí)了miR-455-3p 可靶向負(fù)調(diào)控TRIM27 的表達(dá)，我們推測(cè)miR-455-3p 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的功能可能與TRIM27具有一定的相關(guān)性。

TRIM27 在各種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，TRIM27 的過(guò)表達(dá)有助于各種腫瘤的發(fā)展進(jìn)展及耐藥性［21-22］。Ma的研究報(bào)道TRIM27在卵巢漿液性癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且TRIM27 表達(dá)的下調(diào)在體外和體內(nèi)均抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖［23］。最近，Jiang 等［24］在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TRIM27 在卵巢癌細(xì)胞和異種移植卵巢癌裸鼠中高表達(dá)，抑制TRIM27 可抑制癌細(xì)胞和裸鼠成瘤的進(jìn)一步惡化，產(chǎn)生這種作用與TRIM27正向的miR-383-5p 的靶向調(diào)控相關(guān)。孟易禹等［25］在鼻咽癌的研究中報(bào)道，TRIM27 的表達(dá)水平明顯的升高，下調(diào)TRIM27 可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，提示TRIM27 在鼻咽癌中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本研究檢測(cè)了人鼻咽癌細(xì)胞5-8F、CNE-1和鼻咽上皮細(xì)胞NP69 中TRIM27 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TRIM27 在鼻咽癌中的表達(dá)明顯升高，且敲減TRIM27 可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，這均與孟易禹的研究結(jié)果相一致，也再次驗(yàn)證了TRIM27 在鼻咽癌中的體外調(diào)控功能；除此之外，還發(fā)現(xiàn)敲減TRIM27 可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，這是首次發(fā)現(xiàn)TRIM27 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡調(diào)控作用，為探索TRIM27 在鼻咽癌細(xì)胞中的功能提供充分的理論依據(jù)；深入研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRIM27 可逆轉(zhuǎn)miR-455-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，說(shuō)明不僅miR-455-3p可靶向調(diào)控TRIM27，相反，TRIM27也可逆向調(diào)控miR-455-3p 的表達(dá)和功能。這些結(jié)果為鼻咽癌的基因治療和靶向治療提供了更充分的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

總之，miR-455-3p 抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與靶向TRIM27 有關(guān)，為鼻咽癌的治療提供新靶點(diǎn)。