小兒智力糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

汪玉萍，楊積慧，江厚義，劉軍玲，程世云

作者單位：1安慶市食品藥品檢驗中心，安徽 安慶 246052；

2上海寶龍安慶藥業(yè)有限公司，安徽 安慶 246001；

3安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051

小兒智力糖漿是由龜甲、龍骨、遠(yuǎn)志、石菖蒲、雄雞等5 味藥組成，收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊，標(biāo)準(zhǔn)號為WS3-B-1496-93［1］。2004 年5 月25 日國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（修訂）頒布件ZGB2004-31 將標(biāo)準(zhǔn)中“功能與主治”的內(nèi)容修訂為“開竅益智，調(diào)補(bǔ)心腎，滋養(yǎng)安神等作用。用于心腎不足，痰濁阻竅所致小兒多動，少語，煩躁不安，神思渙散，少寐健忘，潮熱盜汗；兒童多動癥見上述證候者”；標(biāo)準(zhǔn)號修訂為WS3-B-1496-93-2004，其他內(nèi)容未作修訂。檢驗項目包括：性狀、遠(yuǎn)志的薄層鑒別、相對密度檢查及糖漿劑的通則檢查［2］。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為簡單，不能全面有效地控制其藥品內(nèi)在質(zhì)量；因此有必要建立更為完善的質(zhì)量控制體系，以利于對該藥品進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。本研究時間為2021 年1—5 月，在原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了石菖蒲和龜甲的定性鑒別方法，增加了高效液相色譜法（HPLC）測定其遠(yuǎn)志皂苷元的含量，對小兒智力糖漿質(zhì)量控制方法進(jìn)行了較為系統(tǒng)的提高完善，本研究建立的鑒別和含量測定方法為小兒智力糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 全自動點(diǎn)樣儀（CAMAG 公司）；Agilent1260 型高效液相色譜儀（包括G1315D 型DAD檢測器），Agilent 公司；Waters SymmetryShieldTMRP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；雙槽展開缸（規(guī)格10 cm×10 cm；10 cm ×20 cm，上海信誼儀器廠）；硅膠G 薄層板：青島海洋化工廠分廠；Merk 公司。XP26 型電子天平（瑞士梅特勒公司，d=0.001 mg）；S120H型超聲波清洗器（德國Elma公司）。

石菖蒲對照藥材（批號121098-201105）、龜甲對照藥材（批號121494-201102）、丙氨酸對照品（批號140680-201604，含量100.0%）、遠(yuǎn)志皂苷元對照品（批號111572-201803，含量98.5%），對照藥材及對照品購自中國食品藥品檢定研究院。

小兒智力糖漿12 批（批號為190333 、190334、190336、180111 由A 公司提供；批號為180802、180906、181106 由B 公司提供；批號為17060006、18010002、19030001 由C 公司提供，批號為20181002、20181102由D公司提供）。

三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、石油醚（60～90 ℃）、鹽酸、苯酚、硼酸、甲醇等均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。水為純化水。

1.2 方法

1.2.1 薄層色譜鑒別方法

1.2.1.1 石菖蒲 取本品20 mL，加乙醚振搖提取3次，每次30 mL，合并乙醚液，低溫蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為供試品溶液。另取石菖蒲對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液加乙醚振搖提取3次，每次30 mL，合并乙醚液，低溫蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 mL溶解，作為對照藥材溶液。按小兒智力糖漿處方和工藝制備缺石菖蒲的陰性樣品，并按照供試品溶液的制備方法制備成缺石菖蒲陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗，吸取上述對照藥材溶液5～10μL、供試品溶液及陰性樣品各10～15μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

1.2.1.2 龜甲 取本品1 mL，加水20 mL 和鹽酸3 mL，加熱回流60 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，濾過，濾液作為供試品溶液。另取丙氨酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按小兒智力糖漿處方和工藝制備缺龜甲的陰性樣品，并按照供試品溶液的制備方法制備成缺龜甲陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020 年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液及陰性樣品各5～10μL、對照品溶液1～2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以苯酚-0.5%硼酸溶液（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.2%的茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.2 HPLC 含量測定方法 色譜柱為Waters SymmetryShieldTMRP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.05%磷酸溶液（41∶59）為流動相；檢測波長為210 nm，柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10μL，理論板數(shù)按遠(yuǎn)志皂苷元峰計算應(yīng)不低于3 000。精密稱取遠(yuǎn)志皂苷元對照品6.12 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，即得（濃度為0.120 6 g/L），作為對照品儲備溶液。精密量取對照品儲備溶液2 mL 加甲醇稀釋至10 mL 作為對照品溶液。精密量取本品10 mL，置100 mL 具塞錐形瓶中，加12.5%的鹽酸溶液40 mL，搖勻，置沸水浴中加熱回流1 h，立即冷卻至室溫，濾過，濾渣用水沖洗至中性，濾渣及錐形瓶晾干，連同濾紙置原錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方組成比例，取除遠(yuǎn)志以外的其余藥味，按制備工藝要求，制成不含遠(yuǎn)志的小兒智力糖漿陰性樣品，并按照供試品溶液同法制備成陰性溶液。按上述色譜條件，分別精密量取遠(yuǎn)志皂苷元對照品溶液、樣品溶液及陰性樣品溶液各10μL 注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

2 結(jié)果

2.1 薄層色譜分析結(jié)果

2.1.1 石菖蒲薄層色譜鑒別 照薄層色譜法（中國藥典2020 年版四部通則0502）試驗，3 批小兒智力糖漿樣品色譜圖中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，且陰性樣品對鑒別結(jié)果無干擾，薄層色譜圖見圖1。

2.1.2 龜甲薄層色譜鑒別 照薄層色譜法（中國藥典2020 年版四部通則0502）試驗，3 批小兒智力糖漿樣品色譜圖中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。且陰性樣品對鑒別結(jié)果無干擾，薄層色譜圖見圖1。

2.2 遠(yuǎn)志皂苷元含量測定結(jié)果

2.2.1 專屬性試驗 按“1.2.2”項下色譜條件，分別取“1.2.2”項下供試品溶液、“1.2.2”項下遠(yuǎn)志皂苷元對照品溶液和“1.2.2”項下陰性對照溶液進(jìn)樣分析，記錄液相色譜圖，見圖2。實驗表明，處方中其他藥味對遠(yuǎn)志皂苷元的測定無干擾。

圖2 高效液相色譜圖：A為對照品溶液；B為供試品溶液；C為陰性對照溶液

2.2.2 線性關(guān)系的考察 精密吸取“1.2.2”項下對照品儲備溶液0.5、1、2、4、5、10 mL，分別置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，即得。分別吸取10 μL 進(jìn)樣，按“1.2.2”色譜條件測定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），遠(yuǎn)志皂苷元進(jìn)樣濃度（g/L）為橫坐標(biāo)（X），實驗數(shù)據(jù)線性回歸處理，得回歸方程Y=7 928 515.5X+1 202.1（r=0.999 9，n=6）。實驗表明：遠(yuǎn)志皂苷元對照品在所試濃度為0.006 03～0.120 60 g/L 范圍內(nèi)與峰面積積分值具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其遠(yuǎn)志皂苷元峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 取同一批小兒智力糖漿（批號190334）的樣品6份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定供試品中遠(yuǎn)志皂苷元的含量，結(jié)果樣品中遠(yuǎn)志皂苷元含量為0.105 8 g/L，其RSD 為1.78%。實驗表明本法重現(xiàn)性較好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 取配制好的同一供試品溶液，按“1.2.2”項下色譜條件分析，分別于配制后0、2、4、8、12、24 h 精密量取10 μL 注入液相色譜儀。結(jié)果遠(yuǎn)志皂苷元峰面積RSD 為0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 準(zhǔn)確度試驗 分別精密量取遠(yuǎn)志皂苷元對照品甲醇溶液（配制過程：精密稱取遠(yuǎn)志皂苷元3.975 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。濃度為0.391 5 g/L）6 份，每份1 mL，置100 mL 具塞錐形瓶中，蒸干，再精密量取同一批已知含量的小兒智力糖漿（批號190334，含量為0.105 8 g/L）的樣品6 份，每份5 mL 至上述錐形瓶，加水補(bǔ)足至10 mL，按“1.2.2”項下方法處理，濾過，取續(xù)濾液，即得。按“1.2.2”項下色譜條件測定其遠(yuǎn)志皂苷元的含量，計算平均回收率為89.7%，RSD=3.1%。實驗表明：本法準(zhǔn)確性較好。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.7 樣品含量測定 取12 批不同廠家的小兒智力糖漿，分別按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液，對照品溶液和樣品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按“1.2.2.”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算各批樣品中遠(yuǎn)志皂苷元的含量。結(jié)果見表2。

表2 小兒智力糖漿中遠(yuǎn)志皂苷元的含量/（g/L，n=2）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別研究［3-5］在研究石菖蒲薄層色譜鑒別時，分別比較了二氯甲烷、乙醚、石油醚（60～90 ℃）等不同溶劑的提取溶劑，結(jié)果顯示采用乙醚為提取溶劑時樣品斑點(diǎn)清晰，且提取方法簡單可行，故選用乙醚為提取溶劑液，選擇石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm 下）檢視，色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對照無干擾。

龜甲的薄層色譜鑒別中采用了龜甲對照藥材和丙氨酸對照品為對照，結(jié)果龜甲對照藥材與陰性樣品有部分斑點(diǎn)一致，故未將龜甲對照藥材納入標(biāo)準(zhǔn)正文的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

3.2 遠(yuǎn)志的含量測定研究及限度擬定［5-13］根據(jù)國家藥典委員會藥品標(biāo)準(zhǔn)提高課題申報書綜合意見單上要求，增加遠(yuǎn)志專屬性成分的含量測定方法。遠(yuǎn)志為中醫(yī)臨床常用藥，其功效主要有安神益智，交通心腎，祛痰，消腫。遠(yuǎn)志的主要活性成分為皂苷類、酮類、寡糖酯類，其中皂苷類成分主要有遠(yuǎn)志皂苷元、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷、遠(yuǎn)志酸、遠(yuǎn)志皂苷B等，酮類成分主要為遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ；寡糖酯類成分主要為3，6′-二芥子?；崽堑?。開始選擇遠(yuǎn)志口山酮Ⅲ和3，6′-二芥子?；崽亲鳛橹笜?biāo)成分，但小兒智力糖漿樣品中未檢出這兩種成分，再選擇細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定方法研究，因細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為堿水解的二次皂苷，水解條件苛刻，方法重現(xiàn)性差，回收率低。后來再選擇遠(yuǎn)志皂苷元作為指標(biāo)成分。經(jīng)方法學(xué)驗證表明：本法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為該制劑的定量分析控制方法。樣品中遠(yuǎn)志皂苷元的含量高低與生產(chǎn)企業(yè)有關(guān)，C 公司生產(chǎn)的小兒智力糖漿樣品含量最高可達(dá)0.480 5 g/L，而D 司生產(chǎn)的小兒智力糖漿樣品含量僅0.013 6 g/L，這可能與不同企業(yè)購買的遠(yuǎn)志藥材有關(guān)，因《中國藥典》2020 年版一部中遠(yuǎn)志藥材項下無遠(yuǎn)志皂苷元含量測定項，將C 公司生產(chǎn)的三批含量特別高以及D 公司生產(chǎn)的兩批含量特別低的離群樣本棄掉，得平均值為0.130 4 g/L，按照平均值下浮20%的量擬定限度為0.10 g/L，因此暫定樣品中遠(yuǎn)志皂苷元的含量限度定為：“本品每1 毫升含遠(yuǎn)志以遠(yuǎn)志皂苷元（C30H45ClO6）計，不得少于0.10 mg”。

4 結(jié)論

本研究在小兒智力糖漿現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了石菖蒲和龜甲的薄層色譜鑒別，增加了遠(yuǎn)志皂苷元的含量測定。建立了較完整的質(zhì)量評價體系，為小兒智力糖漿的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高完善提供了科學(xué)依據(jù)。

（本文圖1見插圖8-2）