內(nèi)關(guān)穴位埋線對大鼠心肌梗死后心肌肥大的影響及作用機制*

平蘭芝 黃小樓 ，2△ 胡天俊，3 姜 洪，2 吳高鑫，2△

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽550025；3.貴州省盤州市中醫(yī)院，貴州 盤州 553500）

心肌梗死是由急性或持續(xù)性缺血、缺氧引起心肌壞死性疾病[1]，最終導(dǎo)致心力衰竭，引起死亡[2-3]。心肌肥大通常被認為是心肌梗死后的適應(yīng)性反應(yīng)[4]，長期刺激最終發(fā)展為適應(yīng)不良的心臟重構(gòu)和心力衰竭[5]，因此抑制心肌肥大已成為治療心肌梗死的潛在靶點。心肌細胞蛋白質(zhì)合成是心肌肥大的關(guān)鍵特征之一[6]，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調(diào)控蛋白質(zhì)合成[7]，參與了心肌肥大的發(fā)生和發(fā)展[8]。穴位埋線是在傳統(tǒng)針具和針法基礎(chǔ)上建立和發(fā)展起來的一種融合多種療法、多種效應(yīng)于一體的復(fù)合性治療方法[9-10]，是針灸學(xué)的一種延伸和發(fā)展。研究表明[11-12]針刺能夠減少心肌梗死面積，穴位埋線能改善心肌缺血狀態(tài)，產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)[13-14]。本研究通過建立心肌梗死大鼠模型，旨在觀察穴位埋線對大鼠心肌梗死后心肌肥大的影響，進一步探討穴位埋線治療心肌梗死的作用機制，為穴位埋線在臨床上防治心肌梗死提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠20只，8～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證編號：SCXK（湘）2019-0014，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心實驗室，濕度50%～70%，室溫20～25℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后造模。本實驗過程遵照動物倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 試藥與儀器

培哚普利叔丁胺片（施維雅天津制藥有限公司）。HE試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），ANP（ab209232）購自美國Abcam公司，p-mTOR（ab137133-40UL）購自美國 Abcam公司，mTOR（ab32028-40UL）購自美國Abcam公司，p-P70S6K（9204S）購自美國CST公司，P70S6K（2708T）購自美國CST公司，p-4EBP1（2855T）購自美國CST公司、4EBP1（9644T）購自美國CST公司，羊腸線（山東博達醫(yī)療用品股份有限公司）。小動物呼吸機（原陽縣振華教學(xué)儀器有限公司），心電圖機（廣州市三銳電子科技有限公司），高分辨率小動物超聲系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）。

1.3 模型制備

采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)制備大鼠急性心肌梗死動物模型。術(shù)前予1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后將大鼠仰臥位固定于鼠板，剃毛備皮，予氣管插管后連接小動物呼吸機。碘伏消毒術(shù)區(qū)，在胸骨左側(cè)第3、4肋間隙橫向切開皮膚，鈍性分離肌肉組織，沿左第三、四肋打開胸腔，用開胸器置于平行于肋間方向擺放，將無菌濕棉球撕成長條狀向下壓迫左肺以保護肺臟，撕開心包膜，充分暴露心臟，以冠狀動脈主干為標準，用5/0無菌帶線縫合針在左心耳下2 mm處結(jié)扎左冠狀動脈前降支。以結(jié)扎部位及以下心肌變白為結(jié)扎成功的標志。結(jié)扎后腹腔注射0.2 mL利多卡因注射液預(yù)防心律失常和0.2 mL呋塞米減輕心臟容量負荷。取出壓迫左肺的棉球，將心臟復(fù)原，取下開胸器，關(guān)胸縫合，脫離呼吸機，觀察大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管。術(shù)后連續(xù)3 d予青霉素20萬U/d腹腔注射預(yù)防感染。假手術(shù)組同模型組手術(shù)步驟一致，僅將手術(shù)線穿過左冠狀動脈前降支，不結(jié)扎，打松結(jié)。整個手術(shù)過程嚴格無菌操作，心電圖（ECG-3303B）肢導(dǎo)ST段弓背向上抬高并且術(shù)后第2大鼠心電圖I、aVL或V1～V6導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)病理性Q波時為造模成功標志。

1.4 分組與給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、內(nèi)關(guān)埋線組，另設(shè)假手術(shù)組，每組5只。各組分別于術(shù)后第2天開始灌胃給藥及內(nèi)關(guān)穴埋線治療，培哚普利組予培哚普利（40 mg/kg）灌胃給藥，模型組、假手術(shù)組和內(nèi)關(guān)埋線組予等量蒸餾水灌胃，每日1次。內(nèi)關(guān)取穴參照第2版《實驗針灸學(xué)》，將3-0羊腸線剪成0.2～0.5 cm小段，將其從7號一次性埋線針針尖穿入，再將針芯從注射針針尾部穿出。為確保羊腸線準確埋入穴位，內(nèi)關(guān)斜刺6 mm，退出針頭并檢查有無線頭外露。第7天行相關(guān)檢查。

1.5 觀察指標

1.5.1 超聲檢測左心功能指標 各組于取材前1 d行超聲心動檢查，予3%異氟烷吸入麻醉后，取左室短軸切面，探測M型曲線，取3個連續(xù)心動周期，計算平均值。記錄主要參數(shù)：左室射血分數(shù)（LVEF）、左室短軸率（LVFS）、左室舒張末內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮末內(nèi)徑（LVIDs），并統(tǒng)計結(jié)果。

1.5.2 HE染色 處死動物，取心肌組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋切片，染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹脂封片，切片于全景掃描儀中觀察并采集圖像。用Image-J軟件測量橫截面積。

1.5.3 免疫印跡法（Western blotting）檢測梗死邊緣區(qū)心肌肥大指標ANP和蛋白質(zhì)合成相關(guān)指標的蛋白表達 取40 μg樣本蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳20 min，轉(zhuǎn)至PVDF膜，放入5%封閉液中水平搖床震蕩60 min，加入5%封閉液配制好的一抗稀釋液，ANP、mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，15 min，加入相對應(yīng)的二抗（二抗稀釋度1∶1 000）水平搖床震蕩60 min，再次用TBST洗膜3次，10 min，顯影，保存圖像。Image-J軟件進行蛋白灰度值分析，各組目標蛋白灰度值分別與內(nèi)參β-action比較得到相對光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示。多組差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果比較

見表1。與假手術(shù)比較，模型組大鼠LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.05），LVIDd、LVIDs顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，埋線組和培哚普利組LVEF、LVFS顯著升高（P＜0.05），LVIDd、LVIDs顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠心臟超聲結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組埋線組培哚普利組n 5 5 5 5 LVEF（%）81.53±4.66 31.57±3.97*51.42±7.35*△50.56±9.17*△LVFS（%）57.93±6.95 13.75±3.65*22.55±2.39*△23.93±3.38*△LVIDd（mm）6.62±0.49 10.09±1.06*8.52±0.38*△8.33±0.77*△LVIDs（mm）3.38±0.23 7.98±0.28*△6.81±0.37*△6.23±0.59*△

2.2 各組大鼠心肌HE染色及橫截面積比較

HE結(jié)果顯示：假手術(shù)組心肌細胞形態(tài)大小正常，心肌細胞排列整齊有序，細胞核位于細胞中央，未見炎性細胞浸潤。與假手術(shù)組相比，模型組心肌細胞呈現(xiàn)增生肥大改變，細胞形狀不規(guī)則，排列錯亂，細胞核游離，細胞間質(zhì)增多，可見不同程度的炎癥細胞浸潤。與模型組比較，埋線組和培哚普利組心肌細胞的肥大改善，心肌細胞形態(tài)較為規(guī)則，心肌細胞排列相對整齊，細胞核游離情況有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細胞切片（HE染色，400倍）

梗死邊緣區(qū)心肌細胞的橫截面積結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組橫截面積顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，埋線組和培哚普利組橫截面積顯著降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌細胞橫截面積及ANP蛋白表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌細胞橫截面積及ANP蛋白表達水平比較（±s）

組 別n 心肌細胞橫截面積（μm2）ANP蛋白假手術(shù)組模型組埋線組培哚普利組5 5 5 5 232.06±15.74 467.48±56.85*289.74±59.39△274.56±44.40△0.275±0.002 0.846±0.006*0.456±0.004*△0.670±0.003*△

2.3 各組大鼠梗死邊緣區(qū)ANP蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較，模型組ANP蛋白表達顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，埋線組和培哚普利組ANP蛋白表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠ANP蛋白表達條帶

2.4 各組大鼠梗死邊緣區(qū)mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表達比較

與假手術(shù)組比較，模型組p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP1/4EBP1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，埋線組、培哚普利組p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K、p-4EBP1/4EBP1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見表3，圖3。

表3 各組梗死邊緣區(qū)mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表達比較（±s）

表3 各組梗死邊緣區(qū)mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表達比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組埋線組培哚普利組n 5 5 5 5 p-mTOR/mTOR 0.366±0.020 0.860±0.015*0.604±0.011*△0.777±0.022*△p-P70S6K/P70S6K 0.608±0.010 0.628±0.011*0.522±0.024*△0.407±0.014*△p-4EBP1/4EBP1 0.731±0.005 0.999±0.012*0.795±0.009*△0.722±0.008△

圖3 各組大鼠梗死邊緣區(qū)mTOR、P70S6K和4EBP1蛋白表達條帶

3 討論

心肌梗死在中醫(yī)屬“胸痹”范疇，內(nèi)關(guān)既是手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，又是八脈交會穴之一，通陰維脈，為治療胸痹第一要穴，疏通心包絡(luò)及陰維脈之氣血，具有寬胸理氣、通絡(luò)止痛之功[15-16]。故本研究選用內(nèi)關(guān)穴為治療穴位。針灸治療心血管疾病已被證實，臨床研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)關(guān)埋線治療冠心病能夠減少心肌缺血發(fā)作次數(shù)、持續(xù)時間[17]，能良好地調(diào)節(jié)心血管的功能恢復(fù)[18]，且療效顯著。本研究重點觀察內(nèi)關(guān)穴埋線對心肌梗死后心肌肥大的影響，進一步探討內(nèi)關(guān)穴埋線可能的作用機制，并選用培哚普利作為對照組。

心肌梗死發(fā)生后，為了補償功能性心肌細胞的損失，心臟通過一系列的結(jié)構(gòu)改變來完成重構(gòu)[19]。心肌肥大被認為是心臟重塑過程中的關(guān)鍵事件[20]。心房是ANP合成、儲存和分泌的主要部位，參與體液和血壓穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，在高血壓和心臟病合并左室肥厚時，心室ANP的合成和釋放增加[21]。本研究研究顯示，大鼠心肌梗死后7 d ANP表達升高，在接受培哚普利治療和內(nèi)關(guān)穴穴位埋線治療后ANP表達下降，與模型組比較，內(nèi)關(guān)埋線組降低心肌肥大的程度。因此我們推測穴位埋線能夠減輕心肌肥大程度，抑制ANP的表達。

心肌肥大的主要特征是蛋白質(zhì)合成過多、心肌細胞大小增加和心室壁增厚，是導(dǎo)致心律失常和心力衰竭的主要危險因素[22]。mTOR是一種進化保守的非典型絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于磷酸肌醇3-激酶（PI3K）相關(guān)激酶家族，通過其下游效應(yīng)器磷酸化真核起始因子4E（eIF4E）結(jié)合蛋白1（4EBP1）和p70核糖體S6激酶1（S6K1）來促進蛋白質(zhì)合成，進而通過促進蛋白質(zhì)來正向調(diào)節(jié)細胞生長和增殖[23]。P70S6K和4EBP1可以直接反映mTOR的活性[24]，在使用mTOR抑制劑后，磷酸化p70S6K和4EBP1將不再磷酸化[25]。心肌肥大的發(fā)生與發(fā)展受細胞內(nèi)mTOR信號通路的調(diào)控[26]。研究表明，雷帕霉素（mTOR抑制劑）通過抑制p70S6K和4EBP1磷酸化抑制mTOR的活性，進而減輕壓力超負荷引起的心肌肥大[27-28]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1蛋白表達水平均顯著升高；與模型組比較，埋線組與培哚普利組mTOR、p-mTOR、P70S6K、p-P70S6K、4EBP1、p-4EBP1蛋白表達水平均顯著降低。結(jié)合心肌梗死邊緣區(qū)心肌細胞的橫截面積與ANP蛋白表達情況，我們推測穴位埋線可能通過抑制mTOR/p70S6K/4E-BP1信號來抑制蛋白質(zhì)合成，進而改善心肌梗死和心肌肥大，保護心功能。

綜上所述，內(nèi)關(guān)穴埋線改善心功能可能是通過抑制mTOR/p70S6K/4EBP1通路，減少蛋白質(zhì)合成，從而減輕心肌梗死后心肌肥大而實現(xiàn)的。一方面，穴位埋線可以通過抑制p70S6K和4EBP1的磷酸化，抑制mTOR的活性，減少蛋白質(zhì)合成，達到減輕心肌梗死、心肌肥大的目的，實現(xiàn)保護心功能的效應(yīng)。然而本研究缺乏遠期觀察，可將觀察期延長至4個月，同時可加入細胞實驗明確信號通路，這將是我們下一步研究的重點。