離體大鼠肝臟灌流法制備氯吡格雷活性巰基代謝物Δ

劉 藝，陶 婷，劉 云，李艷麗，胡盼盼，姜艷嬌，孫增先（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院/連云港市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港 222002）

氯吡格雷活性巰基代謝物（clopidogrel active thiol metabolite，CATM，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）是氯吡格雷發(fā)揮抗血小板療效的最終活性物質(zhì)[1]。CATM 化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，C3—C16 雙鍵和C4 位手性結(jié)構(gòu)使其具有4 種構(gòu)型，分別為H1（7S，3E，4S）、H2（7S，3E，4R）、H3（7S，3Z，4S）、H4（7S，3Z，4R），其中H1 和H2 為反式CATM、H3 和H4為順式CATM[1]。已有研究表明，人體內(nèi)CATM 的構(gòu)型為順式構(gòu)型[2]。目前市面上僅有反式CATM異構(gòu)體H1、H2的標(biāo)準(zhǔn)品，使CATM的體內(nèi)研究受限。

圖1 CATM化學(xué)結(jié)構(gòu)式

對CATM進行合成的現(xiàn)有技術(shù)中，常用的方法有化學(xué)合成法和生物酶肝微粒體催化法，其中化學(xué)合成法需要對C3—C16 雙鍵構(gòu)型和C4 位手性構(gòu)型進行選擇，步驟復(fù)雜[3]；生物酶肝微粒體催化法具有較高的生物選擇性和轉(zhuǎn)化效率，但肝微粒體成本高，酶催化反應(yīng)條件嚴(yán)苛，同時因底物量受限難以得到足夠的目標(biāo)代謝產(chǎn)物[2]。已有研究顯示，離體大鼠肝臟灌流法被廣泛用于大鼠肝臟的生理、病理生理、肝損傷及藥物代謝研究，兼具體外實驗和整體動物實驗的優(yōu)點[4－6]。本實驗擬采用（S）-2-氧氯吡格雷為底物，采用離體大鼠肝臟灌流法通過代謝途徑制備CATM，旨在為順式CATM的合成提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括肝臟器官灌流儀（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院臨床藥理實驗室設(shè)計）、AKTA pure 型蛋白純化儀（美國General Electric 公司）、DUC-23050-J00型真空冷凍干燥儀（英國GeneVac miVac公司）、Bruker avance ⅢHD 500 型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀（德國Bruker 公司）、Waters Acquity UPLC ⅠClass型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）、AB Qtrap 4500 型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）、T1型氮氣發(fā)生器（瑞士Gravimetrics公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

（S）-2-氧氯吡格雷（批號20200105，純度99.0%）由徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院臨床藥理實驗室自制[7]；氯化鈉（批號20220417，純度99.0%）、氯化鉀（批號20160118，純度99.5%）、七水合硫酸鎂（批號20190625，純度99.0%）、磷酸二氫鉀（批號20190612，純度99.5%）、氯化鈣（批號20181012，純度96.0%）、碳酸氫鈉（批號20160219，純度99.5%）、一水合葡萄糖（批號K1925024，純度98.0%）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨（批號E057G140，純度98.0%）購自德國CNW 公司；鹽酸（批號160112012H）購自南京化學(xué)試劑股份有限公司；肝素鈉注射液（批號52108110，規(guī)格每2 mL 12 500 單位）購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責(zé)任公司；吸入用七氟烷（批號18120331，規(guī)格120 mL）購自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；硫酸氫氯吡格雷片（批號AA976，規(guī)格75 mg）購自賽諾菲（杭州）制藥有限公司；氘代二甲基亞砜（批號296147，同位素純度99.9%）購自美國Sigma 公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）均購自德國Merck公司，其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

SPF 級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠2 只，體質(zhì)量200～250 g，由南通大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（蘇）2019-0001，使用許可證號為SYXK（蘇）2018-0026。大鼠在自然晝夜照明、相對濕度40%～70%、溫度12～26 ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水、進食（普通維持飼料）。

1.4 受試者

招募1名長期服用氯吡格雷的男性穩(wěn)定期冠脈綜合征受試者（75 mg 維持劑量），受試者試驗前被告知試驗方案與目的，并簽署知情同意書。試驗方案經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批件號為LW-20220309001-01。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 Krebs-Henseleit 碳酸氫鹽緩沖液 按Krebs-Henseleit 碳酸氫鹽緩沖液（K-H 液）的經(jīng)典配方（118 mmol/L 氯化鈉，4.7 mmol/L 氯化鉀，1.2 mmol/L 七水合硫酸鎂，1.2 mmol/L 磷酸二氫鉀，2.5 mmol/L 氯化鈣，25 mmol/L碳酸氫鈉[8]），再以終濃度為10 mmol/L的葡萄糖作為能量來源進行配制，具體操作如下：取氯化鈉6.89 g、氯化鉀0.35 g、七水合硫酸鎂0.30 g、磷酸二氫鉀0.16 g、碳酸氫鈉2.10 g、一水合葡萄糖1.98 g、氯化鈣0.27 g，用雙蒸水溶解，并定容至1 000 mL，再用鹽酸調(diào)pH 至7.35～7.45，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.2 （S）-2-氧氯吡格雷灌流液 將（S）-2-氧氯吡格雷0.008 g 充分溶解于3 mL 乙腈中，再加入至297 mL K-H液中，混勻即得。

2.2 灌流方法

根據(jù)Wang 等[9]和Ferrigno 等[10]報道的方法加以改進，具體操作如下：SD大鼠術(shù)前禁食12 h，不禁水，用七氟烷維持吸入麻醉，沿腹直線打開腹腔，將內(nèi)臟輕輕橫置，暴露門靜脈、下腔靜脈（腹腔段），迅速于門靜脈注入100 單位肝素抗凝并插管固定，用提前預(yù)熱至37 ℃的K-H 液以10 mL/min 的流速沖洗肝臟殘血；剪開下腔靜脈（腹腔段），沿腹腔中線往上剪開胸腔，分出下腔靜脈（胸腔段）并插管作為灌流液的流出管，同時結(jié)扎下腔靜脈（腹腔段），形成灌流通路；迅速將完整的肝臟分離出來，轉(zhuǎn)移至37 ℃的灌流室中，待肝臟殘血沖洗干凈后，換80 μmol/L 的（S）-2-氧氯吡格雷灌流液。灌流方式為非循環(huán)灌流。

2.3 CATM 和（S）-2-氧氯吡格雷定性定量分析的色譜與質(zhì)譜條件

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass，UPLC-MS/MS）法進行測定。色譜條件如下：以Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）為色譜柱，以10 mmol/L乙酸銨溶液為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速為0.25 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣室溫度為4 ℃；進樣量為2 μL。質(zhì)譜條件如下：采用電噴霧離子源；采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描母離子，增強子離子模式掃描碎片離子，正離子方式檢出；氣簾氣（N2）壓力為10 psi；碰撞氣模式為High；離子化電壓為5 500 V；溫度為200 ℃；噴霧氣（N2）壓力為30 psi；輔助加熱氣（N2）壓力為30 psi；CATM、（S）-2-氧氯吡格雷的定性離子對分別為m/z356.1→356.1、m/z338.1→338.1；去簇電壓分別為70、175 V；掃描時間均為100 ms；碰撞能量均為5 eV。

表1 CATM和（S）-2-氧氯吡格雷定性定量分析的梯度洗脫程序

2.4 CATM分離純化的色譜條件

以ChromCore 120 C18制備柱（10 mm×50 mm，5 μm）為色譜柱，以水為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速為1 mL/min；進樣量為100 mL。

表2 CATM分離純化的梯度洗脫程序

2.5 CATM的制備

取80 μmol/L 的（S）-2-氧氯吡格雷灌流液300 mL，按“2.2”項下方法以約3.3 mL/min 的流速進行90 min 的非循環(huán)灌流，制備CATM。收集灌流液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜濾過，按“2.4”項下方法進行分離純化，每間隔1 min富集純化后的洗脫物；再按“2.3”項下方法進樣，驗證洗脫物組分，確定目標(biāo)組分的時間收集范圍；富集目標(biāo)組分，冷凍干燥后，稱定質(zhì)量，以最終獲得CATM的物質(zhì)的量與灌流液中（S）-2-氧氯吡格雷的物質(zhì)的量之比計算轉(zhuǎn)化率。

2.6 CATM的鑒定

2.6.1 質(zhì)譜鑒定 取“2.5”項下制備的目標(biāo)產(chǎn)物，用50%甲醇溶解稀釋成500 ng/mL，在正離子模式下，針泵進樣，流速為7 μL/min；在母離子全掃描模式下的掃描范圍為350～360 Da，掃描速度為10 Da/s，掃描時間為5 min，分別確定目標(biāo)產(chǎn)物母離子質(zhì)荷比，并得最佳去簇電壓值；在子離子掃描模式下的初始碰撞能為10 eV，以5～10 eV為步長調(diào)節(jié)，掃描速度為200 Da/s，掃描時間為5 min，獲得子離子信息。

2.6.2 NMR譜鑒定 以氘代二甲基亞砜[核磁共振氫譜（1H-NMR）為2.50 ppm]為溶劑分別測定目標(biāo)產(chǎn)物的1H-NMR譜和重水交換譜。將各氫信號分類編號匯總并依據(jù)NMR命名法（化學(xué)位移、氫分布、峰分裂數(shù)）對分子的單個質(zhì)子氫信號進行共振分配，通過重水交換譜驗證活潑氫信號。

2.7 CATM中4種立體異構(gòu)體相對純度的測定

取500 ng/mL 目標(biāo)產(chǎn)物，按“2.3”項下方法進樣分析，按歸一化法計算其相對純度。

2.8 順式CATM保留時間的確定

受試者口服氯吡格雷后1 h，采集前臂靜脈血2 mL，置于肝素抗凝管中，即刻以4 000×g離心10 min，取上層血漿50 μL，加入乙腈250 μL，渦旋振蕩5 min，再以12 000×g離心5 min，取上清液吹干后，以“2.3”項下初始比例的流動相復(fù)溶，取10 μL，按“2.3”項下方法進樣分析。

3 結(jié)果

3.1 CATM的制備情況

80 μmol/L的（S）-2-氧氯吡格雷經(jīng)過2次離體大鼠肝臟灌流生物轉(zhuǎn)化，得灌流液580 mL，經(jīng)分離純化得目標(biāo)產(chǎn)物2 mg，即48 μmol 的（S）-2-氧氯吡格雷生物轉(zhuǎn)化得5.62 μmol 的目標(biāo)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為11.71%。分離純化后的洗脫液中目標(biāo)組分的色譜圖（圖2A）顯示，有4個峰分別在21.5、22.6、26.7、27.9 min 時被洗脫，其相應(yīng)質(zhì)譜圖較為相似（圖2B），顯示主要碎片離子為m/z155.2、182.8、212.1、296.1，與研究報道類似[11－12]，可確認(rèn)這4 個峰為CATM的4個立體異構(gòu)體。

圖2 分離純化后目標(biāo)組分的色譜圖和質(zhì)譜圖

3.2 目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)譜優(yōu)化后的最佳去簇電壓為60 V，碰撞能量為29 eV，觀察到母離子為m/z356.1、358.1，分別為35Cl和37Cl的同位素峰，峰高比約為3∶1（圖3A）；主要碎片離子為m/z154.8、183.0、212.0、322.0（圖3B），確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物為CATM[11－12]。目標(biāo)產(chǎn)物的裂解示意圖見圖4。

圖3 目標(biāo)產(chǎn)物的母離子和子離子質(zhì)譜圖

圖4 目標(biāo)產(chǎn)物的裂解示意圖

3.3 目標(biāo)產(chǎn)物的NMR譜鑒定結(jié)果

目標(biāo)產(chǎn)物的1H-NMR譜和重水交換譜見圖5。結(jié)果顯示，7.35～7.57（4H，m）為鄰位取代苯環(huán)上氫信號；5.90（1H，s）為烯氫信號；12.24（1H，brs）、3.05（1H，s）為活潑氫信號，重水交換后消失；3.63（3H，s）為甲氧基氫信號；4.71（1H，m）為連氮原子上次甲基氫信號；2.90～2.56（2H，m）、2.09～1.68（2H，m）、3.81～3.86（1H，m）、3.81～3.86（2H，m）為連氮原子上亞甲基及連硫原子上次甲基氫信號；8.32（0.2H，s）、5.20（1H，s）、1.91（0.4H，s）、7.35～7.57（1H，m）為其他雜質(zhì)上氫信號，確認(rèn)目標(biāo)產(chǎn)物為CATM[2]。目標(biāo)產(chǎn)物的1H-NMR 結(jié)果見表3（由于純化的化合物量不足，未獲得CATM的13C-NMR譜圖）。

表3 目標(biāo)產(chǎn)物CATM的1H-NMR結(jié)果（δ/ppm）

圖5 目標(biāo)產(chǎn)物的1H-NMR譜和重水交換譜

3.4 CATM中4個立體異構(gòu)體的相對純度

CATM 的峰1～峰5 的保留時間分別為10.7、21.3、22.3、26.5、27.3 min，峰面積占比（相對純度）分別為7.14%、7.13%、7.23%、63.52%、14.97%，其中峰2～峰5為CATM的4個立體異構(gòu)體。CATM的UPLC-MS/MS色譜圖見圖6。

圖6 CATM的UPLC-MS/MS色譜圖

3.5 CATM活性構(gòu)型保留時間的確認(rèn)及目標(biāo)產(chǎn)物的純度分析

受試者體內(nèi)CATM的色譜圖（圖7）顯示其只有1個主要色譜峰，保留時間為26.3 min，其為人體內(nèi)的順式CATM[2]。結(jié)合“3.4”項下結(jié)果可知，目標(biāo)產(chǎn)物CATM 中保留時間為26.3 min左右（即26.5 min）的色譜峰峰面積占比較高（約63.52%），即目標(biāo)產(chǎn)物CATM 中含有較高的順式CATM。

圖7 受試者體內(nèi)CATM的UPLC-MS/MS色譜圖

4 討論

4.1 質(zhì)譜條件

因為CATM各立體異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)品尚無法商購，不能獲得其母離子和子離子信息，所以在UPLC-MS/MS法中將母離子和子離子均設(shè)為母離子的質(zhì)荷比，碰撞能量設(shè)為5 eV。該方法可以使母離子盡量在四極桿的子離子通道內(nèi)以原型存在，隨后通過離子阱對該母離子進行裂解，得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖，以便進行CATM 各構(gòu)型的鑒定。

4.2 CATM制備純化方法

CATM結(jié)構(gòu)中的巰基基團化學(xué)性質(zhì)活潑，使其制備純化較為困難。在進行C18制備柱純化之前，根據(jù)觀察，所得到的CATM 灌流液難以保存，經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過后得到的澄清液體，在－80 ℃僅能保存7 d左右，故灌流結(jié)束后應(yīng)盡快對其中的目標(biāo)產(chǎn)物進行分離純化，并且制備過程中的每個操作都應(yīng)盡量在4 ℃和避光環(huán)境下進行，以防止其失活。在分離純化過程中，將灌流得到的含CATM 的灌流液在AKTA pure 型蛋白純化儀上以流動相的方式上樣100 mL，分6 次通過C18制備柱分離純化，首先以97%的水相除去灌流液體系中的無機鹽，隨后通過55%的水相等度洗脫CATM，最后以100%的有機相等度洗脫色譜柱中殘留的（S）-2-氧氯吡格雷，洗脫收集時間范圍為57～64 min。

CATM 的轉(zhuǎn)化率為11.71%，轉(zhuǎn)化率受以下因素影響：（1）灌流液在肝組織和灌流管路中存在損失；（2）（S）-2-氧氯吡格雷未充分轉(zhuǎn)化；（3）CATM可能以其他結(jié)合形式存在；（4）CATM 在制備純化過程中因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定造成損失。本研究中，圖6 與圖2A 相比，色譜峰的峰形較差，其原因與色譜柱柱效降低有關(guān)。本研究通過對比人體內(nèi)CATM 活性構(gòu)型的保留時間并結(jié)合文獻[2]分析，確定目標(biāo)產(chǎn)物CATM中保留時間為26.5 min的色譜峰為活性構(gòu)型順式CATM，再結(jié)合“3.4”項下結(jié)果可知，目標(biāo)產(chǎn)物CATM中活性構(gòu)型順式CATM的占比最高。

綜上所述，本研究以（S）-2-氧氯吡格雷為底物，采用離體大鼠肝臟灌流法生物轉(zhuǎn)化和C18制備柱分離純化獲得目標(biāo)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為11.71%；經(jīng)質(zhì)譜和NMR 譜鑒定目標(biāo)產(chǎn)物為CATM，其中順式CATM的占比較高。該方法具有成本低、步驟較為簡單的優(yōu)點，但同時也存在實驗操作技術(shù)要求較高的缺點。