3例攜帶微小額外標(biāo)記染色體的胎兒及其父母染色體核型分析

范美榮，顧志樂，宋旭梅，隨瑞枝

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004；2 寧夏回族自治區(qū)銀川市第一人民醫(yī)院大廟社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站

額外微小標(biāo)記染色體（small supernumer‐ary markerchromosome，sSMC）是指在人類正常染色體核型基礎(chǔ)上額外增加的一條染色體，通過細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)能夠辨認(rèn)、但卻無法確定其來源和結(jié)構(gòu)，其大小在中期分裂相中一般≤20 號染色體［1］。攜帶sSMC患者的臨床表型可以正常，也可以表現(xiàn)出生長發(fā)育遲緩、智力障礙及器質(zhì)性疾病等嚴(yán)重的臨床表征。通常認(rèn)為攜帶由異染色質(zhì)、隨體等不含遺傳物質(zhì)的染色體部分組成的sSMC 的患者表型多正常，且大多遺傳自雙親［2］。而攜帶富含常染色體或性染色體遺傳物質(zhì)的sSMC 的患者則會出現(xiàn)相應(yīng)臨床表型，表型的嚴(yán)重程度主要取決于sSMC 遺傳物質(zhì)來源于哪條染色體、片段大小和嵌合比例等因素［3-4］。傳統(tǒng)染色體核型分析法可識別sSMC，但無法確定sSMC片段來源及染色體變異對臨床表型的影響，給臨床產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢帶來極大困擾。精確分析sSMC的來源和sSMC結(jié)構(gòu)組成是目前產(chǎn)前診斷的研究熱點(diǎn)。微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）技術(shù)是一種分子遺傳學(xué)技術(shù)，通過對全基因組拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）進(jìn)行全方面、高通量的檢測，快速準(zhǔn)確檢測出基因組中的非平衡性變異，可精確判斷sSMC的來源和性質(zhì)，還可以進(jìn)一步預(yù)判胎兒的臨床表型及預(yù)測疾病嚴(yán)重程度［5］，已廣泛應(yīng)用于疑難sSMC 的診療和產(chǎn)前診斷遺傳咨詢中。我們分析了3 例攜帶sSMC 胎兒的染色體核型，并進(jìn)一步用aCGH 技術(shù)明確sSMC 的來源及胎兒可能臨床表征，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017 年1 月至2021 年12 月來本院產(chǎn)前診斷中心就診并進(jìn)行羊膜腔穿刺的孕婦，有三例胎兒羊水染色體核型分析結(jié)果顯示增加一條sSMC。例1 孕婦，26 歲，孕1 產(chǎn)0，因唐氏篩查21-三體高風(fēng)險（風(fēng)險值為1/78）行產(chǎn)前診斷，超聲學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常。例2 孕婦，36 歲，孕1 產(chǎn)0，超聲結(jié)果提示“胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、腦積水、脊柱后凸”，因高齡妊娠及超聲異常行產(chǎn)前診斷。例3 孕婦，38 歲，孕4 產(chǎn)1，第一胎為表型正常女孩，后經(jīng)兩次自然流產(chǎn)，因高齡妊娠及反復(fù)自然流產(chǎn)行產(chǎn)前診斷，超聲學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常。以上3 對夫妻簽署知情同意后進(jìn)行羊膜腔穿刺，胎兒羊水染色體結(jié)果顯示異常后遂召回三對夫婦及例3 胎兒姐姐進(jìn)行外周血染色體檢查，同時采用3 例胎兒的羊水備管進(jìn)行aCGH 檢測。

1.2 羊水及外周血細(xì)胞染色體檢測 ①按照傳統(tǒng)羊水及外周血染色體核型的制備方法。培養(yǎng)后的羊水及外周血細(xì)胞經(jīng)消化、低滲、預(yù)固定、固定、制片、顯帶等步驟后進(jìn)行染色體核型分析。ZEISS 染色體核型分析系統(tǒng)每例計(jì)數(shù)20 個分裂像，分析至少5 個核型，嵌合體計(jì)數(shù)加至100 個分裂像。按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN2020）》確定胎兒染色體核型。②aCGH 檢測 使用美國Af‐fymetrix CytoScan ?HD Array 微陣列芯片進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。包括限制性酶消化、消化產(chǎn)物連接、PCR 擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的純化、片段化、片段化產(chǎn)物的標(biāo)記、芯片雜交和芯片洗滌、染色、掃描等步驟。掃描獲得的數(shù)據(jù)使用Chromosome Analysis Suite 軟件進(jìn)行結(jié)果分析。通過與DGV、DECIPHER、OMIM 等國際公認(rèn)數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行結(jié)果判讀。

2 結(jié)果

常規(guī)G 顯帶320-400 條帶核型分析結(jié)果顯示胎兒1 染色體核型為47，XX，+ mar［78］/46，XX［22］（圖1），即胎兒核型為一嵌合體，隨機(jī)選取100個分裂像進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，其中78%的分裂像攜帶有sSMC，其余22%的分裂像為正常核型。其父母染色體核型均未見異常。胎兒2染色體核型為47，XY，+mar（圖2），其父母染色體核型均未見異常。胎兒3和其父親染色體核型均為47，XY，+mar（圖3），其母親及姐姐染色體核型未見異常。

圖1 胎兒1的47，XX，+mar［78］/46，XX［22］染色體核型

圖2 胎兒2的47，XY，+mar染色體核型

圖3 胎兒3及其父親的47，XY，+mar染色體核型

aCGH 檢測結(jié)果顯示胎兒1 在16 號染色體p11.2～q11.2 區(qū)段存在約15.5 Mb 的嵌合型重復(fù)（arr［hg19］16p11.2q11.2（31，047，011-46，516，484）x3），由于技術(shù)原因的限制對低于30%的嵌合，aCGH 無法檢出，因而未檢測到嵌合型核型。胎兒2在18 號染色體p11.32～p11.21 區(qū)段存在約15.0 Mb 片段的2 次重復(fù)（arr［hg19］18p11.21p11.32（136，227-15，170，636）x4）。胎兒3 的aCGH 檢測結(jié)果顯示為正常。

3 討論

sSMC 的形態(tài)通?？杀憩F(xiàn)為帶有著絲粒的染色體小片段、雙著絲粒染色體或環(huán)狀染色體等。最常見的是攜帶雙著絲粒染色體的sSMC，其次為帶有著絲粒的染色體小片段，而環(huán)狀sSMC 較少見［6］。LIEHR 等［7］回顧分析了大量相關(guān)病例后得出結(jié)論：sSMC在產(chǎn)前診斷的病例中發(fā)生率為0.077%，在存在異常超聲的胎兒中發(fā)生率為2.04%，在新生兒中發(fā)生率為0.043%，在智力或生長發(fā)育障礙患者中發(fā)生率為0.288%?？梢娫诖嬗挟惓１硇偷娜后w中，sSMC是其一個重要的遺傳學(xué)病因。

來源于16 號染色體的sSMC 非常罕見，本研究中胎兒1 的aCGH 結(jié)果顯示在16 號染色體p11.2-q11.2區(qū)段存在約15.5 Mb重復(fù)，內(nèi)含22個OMIM基因，具體位點(diǎn)為31、047、011～46、516、484。該區(qū)段約4 Mb 位于16p11.2 微重復(fù)綜合征（OMIM#614671）（具體位點(diǎn)為28、500、000-35，300，000）區(qū)域內(nèi)，為主要致病區(qū)域，其余部分覆蓋16 號染色體著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，通常無致病性。16p11.2 微重復(fù)綜合征是一類染色體異常疾病，主要臨床表現(xiàn)為低體重、發(fā)育遲緩、小頭畸形、語言遲滯、孤獨(dú)癥譜系障礙、精神分裂癥等。個體表現(xiàn)差異大，具有高度臨床異質(zhì)性［8-9］。但對于16p11.2微重復(fù)綜合征致病的關(guān)鍵基因，如法洛四聯(lián)癥等心臟疾病的候選基因HIRIP3、與特發(fā)性脊柱側(cè)凸密切相關(guān)的的TNX6、SH2B1 等基因、與腦和神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)的MVP、SWZ6L2、KCTD13、DOC2A、MAPK3 等基因，本研究中胎兒1的aCGH結(jié)果顯示其重復(fù)區(qū)域中并未涉及。在胎兒1 的16 號染色體重復(fù)區(qū)域中，無劑量效應(yīng)敏感基因存在，故此片段重復(fù)的臨床意義不明。BAR‐BER 等［10］報道一例攜帶有16 號染色體p11.2～q11.2 重復(fù)的胎兒，5 歲就診時表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩、神經(jīng)發(fā)育障礙、小頭畸形等癥狀，隨訪至10歲時表現(xiàn)出孤獨(dú)癥譜系障礙癥狀。Zerem 等［11］報道一例攜帶有16 號染色體q11.2～q12.1 區(qū)域重復(fù)的4 歲胎兒，生長發(fā)育遲緩，具體表現(xiàn)為出生后12 個月可以坐立，18 個月可以爬行，24 個月獨(dú)立行走，4 歲仍不會說話，同時表現(xiàn)出智力低下、特殊面容等癥狀。本研究中胎兒1 的父母染色體核型結(jié)果均正常，故胎兒為新發(fā)異常，超聲檢查結(jié)果雖未見異常，但不排除出生后出現(xiàn)如相關(guān)文獻(xiàn)報道的生長發(fā)育遲緩、智力障礙等癥狀。臨床醫(yī)師在遺傳咨詢時告知夫婦雙方上述查詢結(jié)果后，孕婦選擇終止妊娠，引產(chǎn)胎兒外表無特殊異常，其家屬拒絕對胎兒做進(jìn)一步檢查。

胎兒2 的aCGH 結(jié)果證實(shí)在18 號染色體p11.21～p11.32 區(qū)段存在約15.0Mb 的片段2 次重復(fù)。查詢DGV、DECIPHER、OMIM 等數(shù)據(jù)庫顯示該區(qū)域重復(fù)為臨床致病性拷貝數(shù)改變，提示該樣本符合18p 四體綜合征（OMIM#614290）核型特征。該綜合征是由sSMC 導(dǎo)致的典型綜合征之一，臨床可表現(xiàn)為新生兒喂養(yǎng)困難、生長發(fā)育遲緩、肌張力異常、智力低下、小頭畸形、脊柱側(cè)凸、斜視等［12］。胎兒2的雙親染色體核型分析結(jié)果均正常，故該胎兒為新發(fā)變異，母親高齡為該病的誘因之一，其機(jī)制可能為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時同源染色體的不分離以及著絲粒的錯誤分裂，導(dǎo)致18號染色體短臂的兩個拷貝形成等臂染色體［13］。18p 四體綜合征重復(fù)區(qū)域包括USP14、SMCHD1、LPIN2、TGIF1、LAMA1 等54 個OMIM 基因，其中USP14 作為泛素蛋白酶體系統(tǒng)的主要成員之一，對細(xì)胞的生長、遷移、炎癥小體活化、激酶活化等過程均起到促進(jìn)作用，在細(xì)胞增殖和凋亡、信號傳導(dǎo)和DNA 損傷修復(fù)中也起重要的調(diào)控作用［14］，異常表達(dá)會造成生長發(fā)育遲緩或癱瘓等癥狀，這可能是胎兒2 出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩的原因之一。SMCHD1基因異常表達(dá)可導(dǎo)致下游相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象及甲基化程度改變，可造成骨骼肌細(xì)胞的凋亡壞死，與面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥相關(guān)［15］，與胎兒2 脊柱側(cè)凸的表型密切相關(guān)。TGIF1 屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子，可通過調(diào)節(jié)類維生素A 來控制前腦的結(jié)構(gòu)，異常表達(dá)會影響神經(jīng)軸發(fā)育的信號通路，可致胎兒產(chǎn)生全腦畸形、前腦無裂畸形、垂體發(fā)育異常、腦積水等癥狀［16］。LAMA1 基因異常表達(dá)可引起小腦及小腦蚓部發(fā)育不全、小腦囊腫、視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、眼球運(yùn)動異常及高度近視等癥狀［17］。TGIF1 和LAMA1 基因的異常表達(dá)與胎兒2 腦積水的嚴(yán)重表型密切相關(guān)。SEBOLD 等［18］對43 名18p 四體綜合征患者進(jìn)行總結(jié)分析發(fā)現(xiàn)所有患者均有發(fā)育遲緩及精神障礙的癥狀。絕大多數(shù)患者出生時患有新生兒并發(fā)癥，如喂養(yǎng)困難、呼吸窘迫及新生兒黃疸等。同時還可能存在其他一些表型，如小頭畸形（50%患者）、斜視（50%患者），癲癇（20%患者）、心臟疾?。?5%患者）、脊髓脊膜膨出（6%患者）、脊柱側(cè)凸（37%患者）、隱睪（39%男性患者）等。后續(xù)隨訪，發(fā)現(xiàn)43 名患者的平均智商為48，部分患者出現(xiàn)焦慮癥、煩躁及自閉癥表型［19］。遺傳咨詢中在告知夫婦雙方2 號胎兒上述可能出現(xiàn)的嚴(yán)重表型后，孕婦選擇終止妊娠，引產(chǎn)胎兒由于孕周尚小，未見明顯外部畸形。

近端著絲粒染色體（即第13、14、15、21、22 號染色體）形成sSMC 的可能機(jī)制為在減數(shù)分裂期間姐妹染色單體發(fā)生了U 型交叉互換，近端著絲粒染色體短臂斷裂后沒有與原來的染色體長臂連接，而是短臂互相連接最終形成sSMC［20］。目前人類基因組測序沒有能夠分析出近端著絲粒染色體短臂及著絲粒附近區(qū)域的具體的基因序列，也就是說這類由近端著絲粒染色體的短臂所組成的sSMC 不含致病基因，不會產(chǎn)生臨床癥狀。本研究中3 號胎兒羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果為47，XY，+mar，通過檢查其父母外周血染色體，發(fā)現(xiàn)胎兒父親同樣存在一條sSMC，大小和形態(tài)均相同，所以胎兒的sSMC 屬于家族遺傳的sSMC。aCGH 檢測結(jié)果顯示3 號胎兒羊水細(xì)胞的分子遺傳學(xué)結(jié)果正常，考慮到胎兒超聲檢查無明顯異常，加之胎兒父親和胎兒攜帶相同的sSMC且父親無特殊臨床表現(xiàn)，因而推測增加的sSMC 為近端著絲粒染色體短臂構(gòu)成的部分四體核型的可能性較大。本文推測該孕婦其他兩次自然流產(chǎn)的可能原因?yàn)檎煞驍y帶的sSMC 在減數(shù)分裂過程中易形成不平衡的配子而造成。經(jīng)充分遺傳咨詢后建議其繼續(xù)妊娠，定期產(chǎn)檢，目前該孕婦已產(chǎn)下一表型正常、發(fā)育良好的健康男嬰。

綜上所述，由于攜帶sSMC 患者的表型效應(yīng)受其來源、嵌合程度、片段大小以及是否含有重要功能基因等多方面的影響，臨床表型復(fù)雜多變。因此對于產(chǎn)前診斷病例中發(fā)現(xiàn)的sSMC，需要結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)方法及更加全面精準(zhǔn)的分子遺傳學(xué)檢測手段來進(jìn)行綜合分析，避免先天性缺陷胎兒的出生，為產(chǎn)前遺傳咨詢提供科學(xué)準(zhǔn)確的依據(jù)。