木尼孜其對(duì)加入順鉑培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞性激素分泌及增殖調(diào)控作用觀察

劉莉，楊銀銀，夏米西努爾·伊力克

新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054

卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）又稱原發(fā)性卵巢功能不全，是指40歲以下的女性絕經(jīng)后血清卵泡刺激素（FSH）>40 IU/L，繼發(fā)閉經(jīng)≥4個(gè)月。POF 的臨床癥狀包括無(wú)排卵、閉經(jīng)、并伴有FSH和LH 水平升高，E2 水平降低［1］。卵巢顆粒細(xì)胞（Granulosa cells，GC）是一種起源于卵巢性索的體細(xì)胞［2］，能夠支持發(fā)育中的卵母細(xì)胞產(chǎn)生類固醇激素和各種生長(zhǎng)因子。GC 可以合成并分泌大量的E2，E2 對(duì)卵泡的發(fā)育起著負(fù)反饋的作用，并且能夠影響FSH、LH 分泌水平。順鉑（cisplatin，CP）是目前臨床上最有效的化療藥物之一［3］。當(dāng)卵巢GC 發(fā)生化療性損傷時(shí)，體內(nèi)的FSH 和LH 水平升高，E2 水平降低。因此檢測(cè)GC 損傷后FSH、LH 和E2 的分泌水平可以側(cè)面的反應(yīng)POF 的嚴(yán)重程度。由于女性性腺對(duì)抗腫瘤藥物敏感度較高，CP 在治療腫瘤的同時(shí)可造成女性卵巢功能損傷，部分患者會(huì)進(jìn)展為不可逆POF［4］。我們前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，中藥木尼孜其可調(diào)解人體免疫力，降低炎癥水平，已用于痛經(jīng)、更年期綜合征、盆腔炎等疾病的治療中。木尼孜其在化療性POF 中的作用及其具體機(jī)制尚不清楚。2020 年11月—2022 年1 月，我們從大鼠卵巢組織分離顆粒細(xì)胞，觀察木尼孜其對(duì)加入CP培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞性激素分泌及細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 5～6 周齡的雌性SD 大鼠60 只，體質(zhì)量（200 ± 10）g；3 周齡的雌性SD 大鼠10只，體質(zhì)量（60±10）g。大鼠均購(gòu)買自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。購(gòu)買自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；DME/F12 培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)Hyclone）；青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone；孕馬血清促性腺激素購(gòu)自Solarbio 公司；CCK-8；卵泡刺激素受體（FSHR）購(gòu)自美國(guó)Bioword公司；CP 購(gòu)自Solarbio；ELISA 試劑盒購(gòu)自Elab‐science 公司；木尼孜其（主要由小茴香、甘草、紅葡萄、無(wú)花果干、玫瑰花瓣等制成的中藥合劑）購(gòu)自新疆烏魯木齊維吾爾自治區(qū)醫(yī)院；EpsonLX-800 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；超凈臺(tái)；倒置顯微鏡；恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 木尼孜其血清制備 將60 只5～6 周齡大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為木尼孜其高、中、低劑量組，每組20只，木尼孜其高、中、低劑量組分別用木尼孜其合劑7.6、3.8、1.9 毫升/只灌胃，早晚各1 次，共灌胃7 d。第7 天早上將2 次劑量一次性灌胃，灌胃結(jié)束1～2 h 內(nèi)采集三組大鼠腹主動(dòng)脈，將同組大鼠血液混合，3 000 r/min離心20 min，獲取高、中、低劑量木尼孜其血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞制備

1.3.1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分離 取3 周齡大鼠10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。皮下注射孕馬血清促性腺激素（PMSG）50 IU/只。注射48 h 時(shí)處死大鼠，分離卵巢組織并清洗，用1 mK的注射器針頭刺破卵泡釋放細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。在卵巢組織中加入0.25%的胰蛋白酶中消化60 min，消化結(jié)束后用濾網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液。將上述兩種細(xì)胞懸液混合后1 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 洗滌收集沉淀后再次離心。用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸離心后細(xì)胞沉淀，在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，48h 后進(jìn)行細(xì)胞換液。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞鑒定 FSHR 特異性表達(dá)于雌性動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞［5］，故采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞FSHR，從而鑒定卵巢顆粒細(xì)胞。將“1.3.1”中分離細(xì)胞接種至6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右時(shí)，PBS 洗滌3 次，加入4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，PBS 洗滌細(xì)胞，加入PBS 稀釋的5%TritonX-100，室溫靜置30 min。加入山羊血清工作液（按照說(shuō)明書稀釋）室溫封閉30 min，棄血清并瀝干（此處不用PBS 清洗）。加入500 μL/孔的FSHR 一抗（1∶200 稀釋），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日加入500 μL/孔的FITC 山羊抗兔二抗，37 ℃恒溫箱中靜置1 h，靜置結(jié)束后用PBS 洗滌。避光滴加500 μL/孔的DAPI 染色液（1∶1 000 甲醇稀釋），避光靜置10 min，PBS 清洗后瀝干PBS 殘液。每孔加入300 μL的抗熒光淬滅封片劑，最后在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野測(cè)算大鼠卵巢顆粒陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。5 個(gè)視野下大鼠卵巢顆粒細(xì)胞陽(yáng)性率均>90%，判定成功分離卵巢顆粒細(xì)胞。

1.4 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分組及木尼孜其血清給予方法 取大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，接種到6孔板中，分為3組，1組18個(gè)復(fù)孔，2、3組各6個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%左右時(shí)，其中1、2組加入5 μg/mL的CP培養(yǎng)48 h［6］，培養(yǎng)后1組再分為三個(gè)亞組，分別加入高、中、低劑量木尼孜其血清培養(yǎng)。2組為CP組，3組為正常對(duì)照組，均用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSH、LH 和E2 檢測(cè) 采用ELISA 法。培養(yǎng)48 h 時(shí)取各組細(xì)胞培養(yǎng)液，ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液FSH、LH 和E2。所有操作均嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.6 各組大鼠顆粒細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h 時(shí)，取各組細(xì)胞，200 μL 的PBS 清洗細(xì)胞，加入10%胎牛血清的培養(yǎng)基和CCK-8 的混合液100 μL（10%胎牛血清的培養(yǎng)基：CCK-8=100∶1），培養(yǎng)2 h用酶標(biāo)儀讀取450 nm波長(zhǎng)處的光密度值（OD450 值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液FSH、LH、E2水平比較 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液FSH、LH、E2水平比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液FSH、LH、E2水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液FSH、LH、E2水平比較（pg/mL，±s）

注：與3 組比較，*P<0.05；與2 組比較，#P<0.05；與低劑量木尼孜其者比較，＆P<0.05；與中劑量木尼孜其比較，ΔP<0.05。

組別1組高劑量木尼孜其中劑量木尼孜其低劑量木尼孜其2組3組FSH LH E2 2.66±0.14#＆Δ 2.03±0.04 2.33±0.11 0.25±0.11*1.72±0.06 57.92± 1.25#＆Δ 59.21± 2.28 76.67± 3.00 511.66±381.48*89.95± 1.23 4.43± 3.68#＆Δ 5.36± 3.78 4.54± 3.28 74.03±37.62*18.41± 7.05

2.2 培養(yǎng)24、48、72 及96 h 時(shí)各組卵巢顆粒細(xì)胞OD450 值比較 培養(yǎng)24、48、72、96 h 時(shí)各組卵巢顆粒細(xì)胞OD450值比較見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)24、48、72及96 h時(shí)各組卵巢顆粒細(xì)胞OD450值比較（±s）

表2 培養(yǎng)24、48、72及96 h時(shí)各組卵巢顆粒細(xì)胞OD450值比較（±s）

注：與3組比較，*P<0.05；與2組比較，#P<0.05；與低劑量木尼孜其者比較，＆P<0.05；與中劑量木尼孜其比較，ΔP<0.05。

組別1組高劑量木尼孜其中劑量木尼孜其低劑量木尼孜其2組3組OD450值培養(yǎng)24 h 培養(yǎng)48 h 培養(yǎng)72 h 培養(yǎng)96 h 0.630±0.033#＆Δ 0.340±0.020 0.520±0.025 0.180±0.005*0.480±0.031 0.860±0.034#＆Δ 0.460±0.020 0.350±0.021 0.430±0.014*0.590±0.013 1.170±0.054#＆Δ 0.550±0.045 0.800±0.065 0.310±0.013*0.640±0.034 0.800±0.064#＆Δ 0.500±0.033 0.650±0.082 0.250±0.007*0.600±0.027

3 討論

化療是臨床上常用的治療癌癥的手段，CP 作為臨床上常用的化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)常常伴隨著對(duì)正常組織，特別是分裂細(xì)胞的損傷。CP 可以對(duì)原始卵泡產(chǎn)生直接的毒性，可能會(huì)導(dǎo)致原始卵泡丟失，導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備枯竭，從而導(dǎo)致POF 的發(fā)生［6-7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，卵巢GC 負(fù)責(zé)傳遞內(nèi)分泌激素以及細(xì)胞信號(hào)分子，從而來(lái)促進(jìn)卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟，卵巢GC作為卵泡閉鎖的始動(dòng)細(xì)胞，發(fā)生凋亡的時(shí)間早于卵母細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞，大量的卵巢GC 凋亡會(huì)影響卵泡的發(fā)育和成熟。卵巢GC 能夠分泌性腺激素來(lái)維持卵巢功能，卵巢GC 的增殖和凋亡與卵巢的功能密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以5 μg/mL順鉑干預(yù)體外培養(yǎng)的卵巢GC來(lái)模擬卵巢早衰GC。

在本次研究中，成功分離并培養(yǎng)了GC，并成功建立了原代卵巢GC 體外培養(yǎng)體系。通過(guò)參考文獻(xiàn)［9-10］中的方法，獲取數(shù)量較多且細(xì)胞純度較高的GC。剛提取出的原代卵巢GC，培養(yǎng)至24 h，細(xì)胞長(zhǎng)出短小的偽足，開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，此時(shí)處于貼壁適應(yīng)期生長(zhǎng)速度相對(duì)慢；48 h～72 h 細(xì)胞的吸光度值明顯增加，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始大量的增殖，可以判斷顆粒細(xì)胞從48 h開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，72 h吸光度值達(dá)到頂峰，72 h 后吸光度值沒(méi)有增加說(shuō)明細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，96 h 后細(xì)胞的吸光度值開(kāi)始下降，說(shuō)明細(xì)胞開(kāi)始死亡。FSHR是一種G蛋白耦聯(lián)受體，特異表達(dá)在卵巢GC 的細(xì)胞質(zhì)中［11-12］，因此本實(shí)驗(yàn)采用FSHR 免疫熒光鑒定提取的卵巢GC，發(fā)現(xiàn)提取培養(yǎng)的細(xì)胞的FSHR的陽(yáng)性率>90%，符合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的要求。

木尼孜其是一種從中草藥混合物中提取的水提物，主要由小茴香、甘草、紅葡萄、無(wú)花果干、玫瑰花（瓣）等制成的中藥合劑，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡［13］。木尼孜其可以有效的調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)激素的合成以及代謝，減少線粒體的氧化和脫氧核糖核酸的損傷，治療內(nèi)分泌紊亂引起的痤瘡、黃褐斑、痛經(jīng)、更年期綜合征以及女性的生殖系統(tǒng)的炎癥［14-16］。由于中藥本身的成分多樣，組成較為復(fù)雜，對(duì)中藥作用機(jī)制的研究目前較少。針對(duì)中藥直接作用體外實(shí)驗(yàn)研究的困難性，在20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者Hiroko lwama首次提出了血清藥理學(xué)的這個(gè)概念，并開(kāi)始用于藥效的評(píng)價(jià)以及中藥相關(guān)作用的研究［17］。目前藥理血清的實(shí)驗(yàn)技術(shù)日趨于成熟，在心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、抗炎、抗菌、抗病毒等的研究中被廣泛的應(yīng)用［18］。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用木尼孜其干預(yù)慢性應(yīng)激卵巢早衰的大鼠一段時(shí)間后，大鼠卵巢的分泌功能得到改善［19］。因此本實(shí)驗(yàn)得到前期實(shí)驗(yàn)的啟發(fā)，探討木尼孜其含藥血清對(duì)卵巢GC 分泌的性激素FSH、LH 和E2 的影響。FSH 和LH 是由同一個(gè)α-亞基（AGSu）組成的二聚體糖蛋白，并且還是與促甲狀腺激素和人絨毛膜促性腺激素同屬一類的異二聚體糖蛋白［20］。FSH 和LH 通過(guò)控制所有脊椎動(dòng)物的性腺發(fā)育和成熟，在腦-垂體-性腺（BPG）軸中發(fā)揮重要作用。FSH 在雌性配子發(fā)生、精原細(xì)胞增殖和卵黃發(fā)生的早期階段起重要作用，而LH 主要參與雌性最終配子的發(fā)生、雌性卵母細(xì)胞成熟和排卵以及雄性精子發(fā)生和精子形成的過(guò)程。機(jī)體內(nèi)FSH和LH 含量的多少是卵巢活動(dòng)的決定因素［21-22］。在卵巢GC中，F(xiàn)SH 刺激卵泡的發(fā)育，LH 參與卵泡的發(fā)育和成熟，并且依賴FSH 和LH 的協(xié)同作用調(diào)節(jié)卵泡形成、GC的生長(zhǎng)、排卵觸發(fā)等。FSH 和LH 的缺陷降低了配子的發(fā)生和性腺類固醇的產(chǎn)生，從而降低了女性的生育力。在卵泡膜細(xì)胞中，LH刺激雄激素的分泌，雄激素被轉(zhuǎn)移到卵巢GC，通過(guò)芳香化酶轉(zhuǎn)化為E2。E2現(xiàn)已被確認(rèn)為是一種卵巢激素，并且是評(píng)估排卵前狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，密切反映卵泡的發(fā)育和排卵的方式［23-25］。在卵泡早期，F(xiàn)SH 水平的增加，觸發(fā)了E2 的分泌，而E2 的大量分泌又反過(guò)來(lái)抑制FSH 的釋放。在卵泡晚期，LH 水平升高，刺激E2 的分泌，在月經(jīng)周期的中期，E2 向下丘腦提供正反饋，引起FSH 和LH 的激增［26］。實(shí)驗(yàn)中用5 μg/mL 的CP干預(yù)細(xì)胞48 h，建立卵巢GC 早衰模型，然后用不同濃度的木尼孜其含藥血清作用相同時(shí)間，2組與3組相比較，F(xiàn)SH 和LH 的水平升高而E2水平下降，說(shuō)明CP 能夠造成卵巢GC的損傷。而木尼孜其含藥血清高劑量組與模型組相比較，F(xiàn)SH和LH的水平下降而E2 水平升高，說(shuō)明高劑量的含藥血清對(duì)損傷的卵巢GC有一定改善作用。進(jìn)而可以說(shuō)明木尼孜其對(duì)卵巢GC 的分泌功能有一定的改善作用。用5 μg/mL 的CP 干預(yù)細(xì)胞48 h，建立化療性卵巢早衰的GC 模型，用CCK-8法比較不同濃度的木尼孜其含藥血清對(duì)CP損傷卵巢GC增殖能力的影響。結(jié)果提示：CP損傷卵巢GC后，用不同濃度木尼孜其含藥血清作用不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)模型組與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞的OD 值減少。用不同濃度木尼孜其含藥血清分別作用于受損的卵巢GC后，發(fā)現(xiàn)各個(gè)劑量的木尼孜其含藥血清都能促進(jìn)卵巢GC 的生長(zhǎng)；其中高劑量（7.6 mL/只灌胃劑量）的含藥血清效果最好，并且隨著含藥血清濃度的增高，細(xì)胞的增殖率升高的越顯著。說(shuō)明木尼孜其含藥血清對(duì)損傷的卵巢GC 的增殖能力有一定改善作用。但是本實(shí)驗(yàn)僅是通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)來(lái)探討木尼孜其對(duì)卵巢早衰GC 分泌性激素的功能以及對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，因此還有待更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，木尼孜其可抑制順鉑培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞FSH、LH表達(dá)、促進(jìn)E2表達(dá)，木尼孜其可促進(jìn)順鉑培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞的增殖，并且木尼孜其濃度越高對(duì)細(xì)胞的增殖效果越明顯。因此在本研究中7.6 mL/只灌胃劑量的木尼孜其對(duì)加入順鉑培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞性激素分泌及增殖調(diào)控作用最佳。