桑葉非腺毛顯微特征常數(shù)的測(cè)定

史　銳　黃曉彤　叢龍嬌　劉斯文　王琪瑤

桑葉非腺毛顯微特征常數(shù)的測(cè)定

史銳黃曉彤叢龍嬌劉斯文王琪瑤

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院遼寧沈陽(yáng)110000）

為優(yōu)化桑葉的顯微定量方法，文章測(cè)定了12個(gè)品種桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)，以便于鑒別不同品種桑葉藥材，為桑葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)，試驗(yàn)以桑葉的非腺毛作為顯微特征結(jié)構(gòu)，運(yùn)用容量分析法優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定不同品種桑葉非腺毛結(jié)構(gòu)的顯微特征常數(shù)。研究結(jié)果表明，不同品種桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)具有一定的差異性，范圍在61.6個(gè)/mg～415.7個(gè)/mg。實(shí)驗(yàn)證實(shí)利用顯微定量法測(cè)定桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)來(lái)作為評(píng)價(jià)桑葉質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是可行的、科學(xué)的，為后續(xù)研究提供了參考。

桑葉；顯微定量；均勻設(shè)計(jì)；質(zhì)量評(píng)價(jià)

桑葉為?？粕僦参锷＃↙.）的干燥葉，又稱“神仙葉”“鐵扇子”等[1]。桑葉味甘、苦，性寒，歸肝、肺經(jīng)[2]，具有清熱解毒、通血下氣、利五臟關(guān)節(jié)、祛風(fēng)涼血、清肝明目、清肺潤(rùn)燥等功效[3]，主要用于治療目赤昏花、肺熱燥咳等病癥[4]?，F(xiàn)代研究表明，桑葉中化學(xué)成分種類十分豐富，主要包括黃酮類[5]、生物堿類[6-8]和多糖[9]等，具有降血糖[10-11]、消炎等多種藥理作用，被廣泛應(yīng)用于臨床。桑葉的顯微結(jié)構(gòu)中柵欄組織多與表皮細(xì)胞相連，且不同種桑葉中柵欄組織數(shù)量相差無(wú)幾；螺紋導(dǎo)管少見(jiàn)；草酸鈣簇晶和方晶的數(shù)量眾多，且結(jié)構(gòu)多重合，難以區(qū)分；細(xì)胞組織與含鐘乳體的大型晶細(xì)胞數(shù)量極少；其中非腺毛的結(jié)構(gòu)較為完整且粗壯，特征較為明顯，容易觀察，故選擇桑葉藥材中的非腺毛顯微結(jié)構(gòu)作為顯微特征物測(cè)定桑葉的顯微特征常數(shù)。

顯微定量法[12]是根據(jù)藥材中一種特定的顯微結(jié)構(gòu)具有固定常數(shù)的特點(diǎn)，主要采用容量分析法或重量分析法評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的中藥鑒定方法[13]，在中藥研究領(lǐng)域使用較廣泛，最常用于中藥材的含量測(cè)定。此外，顯微定量法[14]在易混淆的中藥鑒定和中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用也較為廣泛，中藥材顯微結(jié)構(gòu)的顯微特征常數(shù)與藥材中活性成分的相關(guān)性研究也有一定的進(jìn)展。桑屬在我國(guó)約有11個(gè)品種，在我國(guó)各個(gè)區(qū)域均有分布，因?yàn)樯Ｈ~品種繁多，導(dǎo)致其入藥品種不明確，這嚴(yán)重制約了桑葉的開(kāi)發(fā)利用。利用顯微定量法測(cè)定桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)，豐富了桑屬中桑葉的鑒別方法，創(chuàng)新了評(píng)價(jià)桑葉藥材質(zhì)量的方式，為中藥的質(zhì)量鑒定開(kāi)辟新的途徑。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

藥材：實(shí)驗(yàn)選取桑葉藥材中，雞桑、垂枝桑、廣東桑、長(zhǎng)果桑、山桑、魯桑、白桑、華桑、蒙桑、瑞穗桑采集于江蘇鎮(zhèn)江，新疆白桑、藥桑采集于新疆和田，以上品種桑葉樣品經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國(guó)教授鑒定為?？粕偕?shù)（L.）的葉子。

試劑：水合氯醛與甘油（天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20200907），蒸餾水（娃哈哈集團(tuán)）。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備包括Olympus光學(xué)顯微鏡（上海普赫光電科技有限公司）、電子分析天平（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器設(shè)備有限公司）、KQ5200DB型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）、微量移液器（紹興市上虞英華貿(mào)易有限公司）、中藥篩子（紹興市上虞英華貿(mào)易有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 桑葉藥材水分的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用《中華人民共和國(guó)藥典》[15]（2020版）中的水分測(cè)定方法測(cè)定桑葉樣品的含水量，其中規(guī)定桑葉中水分含量不得超過(guò)15.0%。12種桑葉的水分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑葉樣品的水分在5.35%～7.98%之間，平均含水量在6.30%，樣品間水分差異不大，各樣品含水量均在15%以下。

表1桑葉水分測(cè)定結(jié)果

桑葉樣品編號(hào)名稱采集時(shí)間水分含量/% 1雞桑2021年10月5.78 2新疆白桑2021年10月5.82 3藥桑2021年10月6.85 4華桑2021年10月5.35 5白桑2021年10月6.12

續(xù)表1桑葉水分測(cè)定結(jié)果

桑葉樣品編號(hào)名稱采集時(shí)間水分含量/% 6長(zhǎng)果桑2021年10月5.89 7山桑2021年10月6.23 8瑞穗桑2021年10月6.86 9垂枝桑2021年10月5.53 10魯桑2021年10月7.98 11蒙桑2021年10月6.32 12廣東桑2021年10月7.21

2.2 桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)測(cè)定定量方法條件優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.2.1 桑葉顯微定量條件優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

顯微定量實(shí)驗(yàn)中的影響因素主要有混懸劑用量、樣品粉碎粒度以及樣品的質(zhì)量。由于考慮到顯微定量方法中的影響因素，本實(shí)驗(yàn)采用3因素6水平均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)桑葉進(jìn)行顯微特征常數(shù)測(cè)定，以對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)選，從而優(yōu)化顯微定量方法。桑葉藥材非腺毛顯微定量法的均勻設(shè)計(jì)方案如表2所示。

表2均勻設(shè)計(jì)方案U（6）

樣品號(hào)樣品質(zhì)量/mg粉碎粒度/目加入甘油量/mL 1201004 2401207 3601203 4801006 51001002 61201205

取1號(hào)雞桑樣品，粉碎后分別過(guò)100目和120目篩。精密稱定20 mg、40 mg、60 mg、80 mg、100 mg、120 mg共6份雞桑樣品，分別用水合氯醛多次水飛，之后移入10 mL量瓶中，按照表2各自加入相應(yīng)的甘油量，用水合氯醛定容。將溶液充分搖勻，精密吸取20μL混懸液制作顯微裝片，6份樣品分別平行制作裝片10張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計(jì)數(shù)。將所得結(jié)果隨機(jī)分成5組，分別計(jì)算平均值的RSD值，以每份樣品平均值的RSD值為考察指標(biāo)，運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析，得到均勻設(shè)計(jì)方案的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3均勻設(shè)計(jì)方案U（6）的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樣品號(hào)樣品質(zhì)量/mg非腺毛的RSD值/% 1208.11 2405.05 3604.15 4809.22 51009.45 61204.91

2.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以每組桑葉藥材非腺毛數(shù)量平均值的RSD值（）為指標(biāo)，1為樣品質(zhì)量，2為粉碎粒度，3為加入甘油量，得出回歸方程為=30.043-0.2112，2=0.934，=71.540，=0.001＜0.05，說(shuō)明整體上理論回歸模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果方程，1與3并沒(méi)有進(jìn)入方程，說(shuō)明1與3對(duì)顯微特征常數(shù)測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)影響，即桑葉中非腺毛顯微定量的優(yōu)化條件為樣品重量60.00 mg，粉碎粒度為120目，加入甘油量為3 mL。

2.2.3 桑葉非腺毛顯微特征常數(shù)測(cè)定均勻設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)雞桑樣品，粉碎后過(guò)120目篩，精密稱定60 mg樣品3份，用水合氯醛多次水飛后轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，加入3 mL甘油，用水合氯醛定容至刻度，搖勻后精密吸取20 μL混懸液，平行制片10張，在顯微鏡下觀察非腺毛并計(jì)數(shù)，將觀察統(tǒng)計(jì)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)隨機(jī)化分組，計(jì)算平均值的RSD值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4均勻設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樣品號(hào)樣品質(zhì)量/mgRSD值/% 160.14.12 260.34.05 360.04.11

根據(jù)上述均勻設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每份樣品的RSD值均接近于最小變異系數(shù)4.15%，說(shuō)明由SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件所給出的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果是準(zhǔn)確的、科學(xué)的。

2.2.4 桑葉非腺毛顯微特征常數(shù)測(cè)定

精密稱取12種桑葉粉末，每種桑葉藥材稱取60.0 mg，各3份，按照2.2.1項(xiàng)下的條件，稱取粉末后用水合氯醛多次水飛，并定容至10 mL量瓶中，吸取20μL混懸液，平行制裝片10張，于顯微鏡下觀察非腺毛并計(jì)數(shù)，取非腺毛的平均值后按照如下公式（1）計(jì)算桑葉藥材中非腺毛顯微特征常數(shù)（），結(jié)果如表5所示。

=（×）/（’×） （1）

上述公式中，為非腺毛顯微特征常數(shù)值，為每張裝片中非腺毛的數(shù)量，為桑葉樣品混懸液的總體積（mL），’為每張裝片的混懸液體積（mL），為桑葉樣品質(zhì)量（mg）。

表5桑葉顯微特征常數(shù)測(cè)定結(jié)果

樣品編號(hào)名稱顯微特征常數(shù)值/個(gè)/mg 1雞桑350 2新疆白桑134.2 3藥桑312.6 4華桑96.6 5白桑142.5 6長(zhǎng)果桑413.4 7山桑81.0 8瑞穗桑132.3 9垂枝桑415.7 10魯桑132.3 11蒙桑61.6 12廣東桑130.6

由表5可知，12個(gè)品種桑葉非腺毛的顯微特征常數(shù)值具有一定的差異，其中顯微特征常數(shù)值最大的為垂枝桑415.7個(gè)/mg，最小的為蒙桑61.6個(gè)/mg。顯微特征常數(shù)的測(cè)定可為后續(xù)開(kāi)展顯微特征常數(shù)與化學(xué)成分含量的相關(guān)性研究以及建立完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果，可在未提取桑葉藥材前，對(duì)桑葉進(jìn)行顯微特征常數(shù)測(cè)定，有利于判斷桑葉藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，為明確桑葉最佳入藥品種奠定基礎(chǔ)。

3 討論

本研究利用顯微定量方法測(cè)定桑葉藥材非腺毛的顯微特征常數(shù)，以非腺毛作為顯微特征結(jié)構(gòu)，具有一定的專屬性。本實(shí)驗(yàn)建立的顯微定量方法有助于更方便、快捷地評(píng)價(jià)桑葉的質(zhì)量，對(duì)桑葉產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用具有一定的意義。

進(jìn)行顯微定量實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要對(duì)不同品種桑葉樣品進(jìn)行粉碎及過(guò)篩，由于過(guò)篩的粒度不同，會(huì)存在非腺毛結(jié)構(gòu)破碎的情況。因此，在對(duì)非腺毛進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)時(shí)，取較為完整的非腺毛計(jì)為一個(gè)單位，結(jié)構(gòu)大于50%的非腺毛也計(jì)為一個(gè)單位。在進(jìn)行顯微裝片時(shí)，蓋玻片需要將混懸液全部覆蓋且不能外溢，以減少誤差的產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)桑葉進(jìn)行顯微定量分析，發(fā)現(xiàn)同屬不同品種桑葉的顯微特征常數(shù)具有一定的差異。其中最大的是垂枝桑，顯微特征常數(shù)是415.7個(gè)/mg；最小的是蒙桑，顯微特征常數(shù)是61.6個(gè)/mg。本實(shí)驗(yàn)方法具有一定科學(xué)性、可靠性，因此利用桑葉顯微特征常數(shù)之間存在的差異，可作為評(píng)價(jià)不同品種桑葉藥材的依據(jù)。

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10.3969/j.issn.2095-1205.2022.06.03

S888

A

2095-1205(2022)06-08-03

遼寧省教育廳項(xiàng)目（L201938）

史銳（1979- ），男，漢族，遼寧本溪人，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。