HSPA9基因變異在Even-plus綜合征胎兒產(chǎn)前診斷中應用：一個復發(fā)性腦積水家系的致病原因分析*

楊 春，喬鳳昌，孟露露，張翠平，許爭峰*

(1.常州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科,常州 213000;2.南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,南京 210000)

Even-plus綜合征(OMIM:616854)是一種常染色體隱性遺傳病，是先天性腦部及骨骼等多系統(tǒng)發(fā)育異常較為罕見的類型。該病是由HSPA9基因變異所致[1]。HSPA9基因位于5號染色體長臂3區(qū)1帶，全長約18kb，有17個外顯子，在序列上高度保守，編碼679個氨基酸構成線粒體蛋白。有研究顯示，HSPA9不同位點的基因突變可導致帕金森病、骨髓異常增生綜合征、急性髓系白血病、貧血、糖尿病心臟病、腫瘤等情況[2-6]。但其導致胎兒期組織器官發(fā)育異常的研究鮮有報道，目前全球范圍內(nèi)迄今為止僅有5例因該基因變異導致患兒發(fā)生組織器官發(fā)育異常的案例報道[7]，因此對此疾病的診斷缺乏經(jīng)驗，特別是產(chǎn)前的胎兒表型及診斷尚無報道。本研究對患有Even-plus綜合征的胎兒及父母進行外顯子測序分析，明確該家系兩次胎兒側腦室增寬、鼻骨發(fā)育不良等表現(xiàn)的致病原因，為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷及進一步生育方案選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究資料 選取2021年3月于南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院就診的1個Even-plus綜合征家系。先證者為2019年8月因“孕12+4周，超聲提示雙側側腦室增寬分別為11.3mm和11.2mm，見少量腦組織漂浮其中、鼻骨顯示不清”的引產(chǎn)兒。引產(chǎn)組織行染色體微陣列分析未見異常。先證者母親于2020年5月，再次因“孕13+1周超聲檢查提示胎兒頸項透明層增厚3.1mm，胎兒腦積水、胎兒臍膨出可能”引產(chǎn)。胎兒母親28歲，父親29歲，表型均正常，非近親結婚，否認家族遺傳病史，共妊娠2次，第一胎兒及第二胎兒均因胎兒側腦室增寬，腦積水可能、鼻骨發(fā)育異常、臍膨出等原因于孕13周左右引產(chǎn)，兩次妊娠的超聲檢查結果見圖1。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會批準，家系成員均簽署知情同意書。

圖1 2019年(圖A、B、C)和2020年(圖D、E、F、G、H)兩次妊娠超聲檢測結果

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 收集先證者父母外周血2mL、兩次引產(chǎn)胎兒絨毛組織各1g，剪碎后備用。按QIAamp DNA試劑盒(QIAGEN公司，德國)標準操作流程提取皮膚組織中的基因組DNA。采用NanoDrop分光光度計進行DNA濃度及質(zhì)量檢測，選擇DNA量大于500ng、DNA濃度大于30ng/μL、A260/280比值在1.8～2.0間的樣本進行后續(xù)實驗。

1.2.2 外顯子測序檢測 基因組DNA經(jīng)超聲打斷后進行建庫，采用IDT The xGen Exome Research Panel v1.0全外顯子捕獲芯片捕獲基因組外顯子區(qū)域后經(jīng)Nextseq 2000 DNA測序儀完成測序。將測序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19(GRch37)參考序列進行對比。

1.2.3 生物信息學數(shù)據(jù)分析 測序獲得的fastq數(shù)據(jù)用BWA0.6.2-r126軟件與參考基因組(UCSC hg19 Feb.2009)進行比對。SAMtool軟件用于去除重復序列，GATK軟件進行局部比對和堿基質(zhì)量校正，得到單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNVs)和<50bp的短插入/缺失(short insertions and deletions，indels)。隨后運用ANNOVAR軟件對SNVs、indels位點進行注釋，經(jīng)人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫(gnomAD)對變異位點進行過濾(最小等位基因頻率<0.05)，Revel、PolyPhen-2、SIFT和Mutation Taster等軟件進行危害性預測以及HGMD、ClinVar、OMIM、Pubmed等數(shù)據(jù)庫核對基因、表型及報道的相關數(shù)據(jù)。候選變異位點根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG，2015)遺傳變異分類標準與指南對突變位點進行致病性分析。

1.2.4 Sanger測序 根據(jù)篩選結果，對目標序列進行PCR后，經(jīng)ABI3730測序儀進行Sanger測序,對家系成員進行變異位點驗證，并經(jīng)序列分析軟件得到驗證結果。應用NCBI primer blast進行引物設計，針對HSPA9基因c.1822-1G>A位點擴增的正向引物序列為5'-CTTGTACCTTTTTGTATGCCATTTC-3'，反向引物序列為5'-TGCCAGTGAAGTTTATTTTTCTGTG-3'，擴增片段長度280bp；同法擴增HSPA9基因c.1411-3T>G位點的正向引物序列為5'-TCCAAGGAGTTTGTTGTCTCCA-3'，反向引物序列為5'-ACCGTAAATTAGGAGTCTTCCAGT-3'，擴增片段長度208bp。擴增體系:PCR反應體系為25μL，包括12.5μL mix，10μL ddH2O，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL。反應條件：95℃ 10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35個循環(huán)；72℃ 10min。PCR產(chǎn)物送至擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

2 結 果

2.1 基因變異檢測結果 對先證者皮膚組織DNA進行外顯子測序檢測，20×覆蓋度為99.63%，平均測序深度為167。檢測出10個可疑致病位點，其中與先證者表型相關的變異為位于5號染色體上HSPA9基因c.1822-1G>A和c.1411-3T>G復合雜合變異。見表1。

表1 先證者及弟弟與HSPA9基因變異相關信息

2.2 Sanger測序結果 先證者及其弟弟HSPA9基因存在c.1822-1G>A和c.1411-3T>G復合雜合變異，分別遺傳自父母。見圖2。

圖2 HSPA9基因突變位點Sanger測序結果

2.3 變異的致病性分析HSPA9基因c.1822-1G>A位點位于經(jīng)典±1/2的剪接位點，極可能影響15號外顯子的剪切導致蛋白編碼異常(PVS1_strong);該變異在人群頻率數(shù)據(jù)庫如gnomAD、千人基因組等中均未收錄，為罕見變異(PM2_supporting)；兩例胎兒均攜帶此變異(PP1)；攜帶該變異的胎兒癥狀與基因相符(PP4);依據(jù)ACMG指南該變異為可疑致病(PVS1_strong+PM2_supporting+PP1+PP4)。c.1411-3T>G位點在人群頻率數(shù)據(jù)庫gnomAD、千人基因組等中均未收錄，為罕見變異(PM2_supporting)；反式位置存在致病性變異(PM3)；兩例胎兒均攜帶此變異(PP1)；該位點位于經(jīng)典剪接位點附近，該變異位點經(jīng)剪接位點危害性預測軟件(mmsplice、dbSNV_ADA、Spidex_z score)預測為可能影響剪接的有害突變(PP3);攜帶該變異的胎兒癥狀與基因相符(PP4)。依據(jù)ACMG指南該變異為可疑致病變異(PM2_supporting+PM3+PP1+PP3+PP4)。見表2。

表2 Even-plus綜合征案例表型與基因變異匯總

3 討 論

HSPA9基因位于5q31，全長約18kb，有17個外顯子和16個內(nèi)含子，在序列上高度保守。其編碼蛋白熱休克蛋白A9(heat shock protein,HSPA9)是熱休克蛋白70(HSP70)家族成員之一，主要位于線粒體，也可定位于細胞基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞膜。HSPA9可與新合成的多肽結合，保護大多數(shù)器官中的多肽免受應激導致的錯誤折疊和聚集，并負責促進其穩(wěn)定性、折疊和降解，以維持細胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[9]；作為蛋白質(zhì)輸入馬達的核心組成部分，HSPA9是核基因編碼的線粒體蛋白轉(zhuǎn)入線粒體這一過程的關鍵組成部分，其功能異常可導致線粒體蛋白組生物學特征和功能改變[6]。HSPA9與細胞的各項生理活動密切相關，其功能主要與延長細胞壽命、胞內(nèi)物質(zhì)運輸、線粒體產(chǎn)能、分子伴侶、原癌基因轉(zhuǎn)化、使腫瘤細胞低分化和應激反應等相關。在正常的細胞環(huán)境中，它們與特定的伴侶結合，特別是DNAJ伴侶家族，以及特定的核苷酸交換因子(NEF)家族共同發(fā)揮作用。此外,其還可識別和結合暴露出疏水殘基的錯誤折疊或變性的蛋白質(zhì)，提呈泛素化并靶向蛋白酶體對其進行降解[10]。HSPA9在細胞內(nèi)是一種抗凋亡蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[11-13]。此外，其表達失調(diào)、突變和翻譯后修飾通常被認為是神經(jīng)障礙、遺傳疾病的主要原因[14]。HSPA9不同位點的基因突變和表達異?？蓪е屡两鹕?、骨髓異常增生綜合征、急性髓系白血病、貧血、糖尿病心臟病、精子活力下降、乳腺癌、結腸癌、胸腺癌、前列腺癌等情況[2-5,10,15-18]。然而，HSPA9基因在組織胚胎發(fā)育過程中的研究甚少。

Even-plus綜合征是一種由于HSPA9基因突變導致的骨垢(E)、椎骨(V)、耳(E)、鼻(N)及其他系統(tǒng)癥狀(plus)的遺傳性疾病[1]，具體可表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)(透明隔發(fā)育不全、胼胝體發(fā)育不全、發(fā)育遲緩、肌張力減退)、面部異常(短頭、連眉、弓形眉、外耳發(fā)育不全、鼻骨發(fā)育不全、三角形鼻孔、單上中切牙)、胸部及胸骨短小、13對肋骨、半椎體、乳頭移位、腎積水、單側隱睪、單側掌褶、雙足內(nèi)翻、骨骼異常、先天性心臟病等[1]，是極為罕見的常染色體隱性遺傳病。根據(jù)Orphanet數(shù)據(jù)庫記載，其發(fā)病率不足1/1000000。有關HSPA9變異導致人類組織器官發(fā)育異常目前僅有5例Even-Plus綜合征患者的個案報道[1,7-8]。存活兒可有典型性的顱面部表現(xiàn)、骨骼發(fā)育異常，如X線攝片可見骨齡延遲、骨垢骨化不良及髖關節(jié)發(fā)育不全，脊椎側位片可診斷椎體冠狀位裂等[1]及其他系統(tǒng)的異常表現(xiàn)(表2)。有研究顯示[9]，HSPA9參與多種細胞功能，如線粒體蛋白導入、折疊、降解、鐵硫簇發(fā)生、線粒體穩(wěn)態(tài)和抗凋亡蛋白p53的調(diào)節(jié)。HSPA9基因的突變，特別是在編碼核苷酸結合域內(nèi)的突變，可引起編碼氨基酸結構和功能的改變，如破壞ATP水解，結構域間連接結合、熱穩(wěn)定性和聚集傾向增加等，從而導致一種常染色體隱性遺傳性的疾病，即Even-Plus綜合征[19]。

在臨床上發(fā)現(xiàn)的這一家系反復兩次在早孕期超聲發(fā)現(xiàn)胎兒側腦室增寬、腦部發(fā)育異常、鼻骨發(fā)育不良、臍膨出等超聲異常表現(xiàn)，因胎兒較小，組織器官尚未發(fā)育完善，未能發(fā)現(xiàn)骨骼、心臟等系統(tǒng)的發(fā)育情況，但可見鼻骨發(fā)育不全，面中部扁平，且兩次妊娠胎兒均存在腦室嚴重增寬，顱內(nèi)見少量腦組織漂浮其中，考慮其腦部發(fā)育異常，在頭面部表型上與已報道的5例已出生的患兒表型相符。雖然心臟發(fā)育是否異常不能判斷，但先證者弟弟胎兒頸項透明層增厚，亦不排除先天性心臟病的可能性(備注：胎兒頸項透明層增厚有10%的可能是由先天性心臟病引起)。

綜上所述，結合該家系的外顯子測序結果、表型、遺傳方式，考慮先證者及弟弟的HSPA9基因c.1822-1G>A和c.1411-3T>G復合雜合變異，分別遺傳自父母，為該家系的致病原因。這兩個變異位點目前世界范圍內(nèi)未見報道，且該位點變異導致的胎兒異常超聲表現(xiàn)目前未見報道，本發(fā)現(xiàn)擴展了HSPA9基因變異的突變譜和表型。該夫妻每生育一胎均有1/4患病幾率，在此基礎上指導該家系下一步生育方案為三代試管行胚胎植入前診斷排除疾病。

由于本病的發(fā)病率低，且常規(guī)染色體核型及芯片檢查難以發(fā)現(xiàn)其基因水平的點突變及其他微小變異，但隨著分子遺傳學的進展，尤其是外顯子測序甚至全基因測序的應用，其報道將會逐漸增多。因此，對于影像學檢查發(fā)現(xiàn)異常尤其是重復發(fā)生的結構異常胎兒，經(jīng)常規(guī)染色體微陣列未能發(fā)現(xiàn)與致病變異相關的異常者，建議繼續(xù)利用分子遺傳學的新技術，如家系外顯子測序甚至全基因測序檢查以輔助發(fā)現(xiàn)潛在的基因突變等致病變異，以期幫助尋找致病原因，為今后科學選擇再孕方法提供可靠依據(jù)和幫助。