地衣芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化和抑菌活性測定

張 鈺，馬 曦，趙金標(biāo)，魯 琳

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193)

抗生素能通過其分子結(jié)構(gòu)識別靶細(xì)菌膜表面的結(jié)合位點(diǎn)[1]，抑制細(xì)菌生長甚至滅殺細(xì)菌。畜牧業(yè)中使用抗生素雖能提高畜禽的生長性能，但同時(shí)也帶來許多危害[2-3]。目前，全球畜牧業(yè)禁抗已成為趨勢，歐盟畜牧業(yè)在20世紀(jì)末陸續(xù)禁用維吉尼亞霉素、螺旋霉素等多種抗生素[4]。但各國畜牧業(yè)禁抗后陸續(xù)出現(xiàn)畜禽生產(chǎn)性能下降，疾病發(fā)生率上升等問題[5-6]。中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告規(guī)定自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，自2020年7月1日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。尋找合適的替抗產(chǎn)品對中國畜牧業(yè)今后的發(fā)展極為重要。

地衣芽孢桿菌作為替代抗生素的飼用益生菌，能分泌纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等多種外源酶[7]，可幫助畜禽消化飼料[8]，改善腸道組織結(jié)構(gòu)[9-10]。地衣芽孢桿菌具有廣泛的抑菌譜，能抑制致病菌黏附在腸黏膜表面，并通過分泌多種脂肽類抑菌物質(zhì)來抑制致病菌的生長[11-13]，且對部分真菌及霉菌具有良好的抑制作用[14]。此外，有研究顯示，親緣個(gè)體間的腸道菌群存在相似性[15]，地衣芽孢桿菌改變畜禽親代腸道菌群可能對子代腸道微生物區(qū)系造成影響。目前，地衣芽孢桿菌已被歐美多國批準(zhǔn)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[16-17]。

地衣芽孢桿菌在畜牧業(yè)中應(yīng)用還需探究發(fā)酵過程中的各項(xiàng)參數(shù)，且不同地衣芽孢桿菌菌株可能攜帶有不同抗生素抗性基因[18]，需探究其生物安全問題。本研究基于前期篩選得到的1株地衣芽孢桿菌19148，測定其在體外發(fā)酵的抑菌活性及適宜的發(fā)酵條件，分析其對多種抗菌藥的耐藥性，以期為下一步利用地衣芽孢桿菌生產(chǎn)畜禽發(fā)酵飼料，探究其發(fā)揮益生功能的機(jī)理機(jī)制提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

地衣芽孢桿菌19148(Bacilluslicheniformis19148)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心分離和保存[19]；供試致病菌大腸桿菌(EscherichiacoliK88)、鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaTyphimurium)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus1882)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、MHA培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)。

1.3 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

1.3.1 不同pH對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設(shè)置pH 2.0～12.0共11個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。用1 mmol/L的NaOH和0.5 mmol/L的HCl調(diào)整LB液體培養(yǎng)基pH。制備好的培養(yǎng)基用高壓滅菌鍋滅菌，冷卻后用無菌接種環(huán)挑取地衣芽孢桿菌19148單菌落接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)得到的菌液7 500 r/min離心15 min，取上清液，用0.2 μm濾膜過濾制成無菌濾液。另用無菌生理鹽水分別將大腸桿菌K88、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌1882菌液稀釋至D600 nm值為0.05，按照1∶50的比例與LB固體培養(yǎng)基混合后，取20 mL倒入培養(yǎng)皿，牛津杯打孔后向孔中加入200 μL無菌濾液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑。

1.3.2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設(shè)置4、25、37、45和75 ℃共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將接種后的培養(yǎng)基置于相對應(yīng)的溫度條件下，200 r/min培養(yǎng)24 h。取菌液制備成無菌濾液，以牛津杯抑菌試驗(yàn)檢測其抑菌活性。

1.3.3 不同濃度金屬離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌效果的影響 設(shè)置0、1、2、4 mmol/L的銅離子組和鎂離子組共8個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。用硫酸銅和硫酸鎂調(diào)整LB液體培養(yǎng)基中銅離子和鎂離子的濃度，無菌接種環(huán)挑取單菌落進(jìn)行接種，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。取菌液制備成無菌濾液，以牛津杯抑菌試驗(yàn)檢測其抑菌活性。

1.4 地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵最適條件探究

用接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基表面的地衣芽孢桿菌19148單菌落，接種到盛有50 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中(100 mL規(guī)格)，放入搖床37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h后作為種子液，后續(xù)試驗(yàn)用種子液進(jìn)行液體接種，并以無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑為指標(biāo)，探究地衣芽孢桿菌19148的最適發(fā)酵條件。

1.4.1 不同種子液接種量對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 設(shè)置1%、3%、5%和7%接種量共4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。向滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中按照種子液體積百分比進(jìn)行接種，37 ℃、200 r/min發(fā)酵24 h，發(fā)酵液經(jīng)離心過濾后制成無菌發(fā)酵濾液，以牛津杯抑菌試驗(yàn)檢測其抑菌活性。

1.4.2 不同發(fā)酵時(shí)間對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 設(shè)置16、20、24、28和32 h共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。將種子液按照1%體積百分比接至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min發(fā)酵，并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取樣，制備成無菌發(fā)酵濾液，以牛津杯試驗(yàn)檢測其抑菌活性。

1.4.3 不同搖床轉(zhuǎn)速對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 設(shè)置100、150、200、250和300 r/min共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。LB液體培養(yǎng)基中接種1%種子液，37 ℃發(fā)酵24 h后以牛津杯試驗(yàn)檢測無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性。

1.5 地衣芽孢桿菌19148耐藥性評價(jià)

以麥?zhǔn)媳葷峁茏鳛閰⒖紭?biāo)準(zhǔn)，用無菌生理鹽水將地衣芽孢桿菌19148菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?MCF)，菌液濃度約為1.5×108CFU/mL，并用LB培養(yǎng)基作為比對，排除培養(yǎng)基本身顏色對的菌液濁度的干擾。用無菌棉拭子蘸取少量稀釋后的菌液涂布于MHA培養(yǎng)基表面，待干燥后將含有不同抗菌藥的濾紙片貼附在MHA培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。無抑菌圈或抑菌圈直徑<10 mm為耐藥，抑菌圈直徑在10～15 mm之間為中介，抑菌圈直徑>15 mm為敏感。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010和SPSS 23.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對不同處理組間的差異進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

2.1.1 不同pH對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 pH為2.0、3.0、4.0、10.0、11.0、12.0處理組地衣芽孢桿菌19148生長受到抑制，菌液較為澄清。pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0處理組地衣芽孢桿菌19148有明顯的生長跡象，其無菌濾液對金黃色葡萄球菌1882沒有抑制效果，對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌有明顯的抑制作用，其中pH 5.0、6.0和7.0處理組的抑菌效果顯著高于pH 8.0和9.0處理組(P<0.05)，且3組間無顯著差異(P>0.05)(圖1)。

大腸桿菌K88組間，不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；鼠傷寒沙門氏菌組間，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.1.2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 4和75 ℃處理組地衣芽孢桿菌19148生長明顯受到抑制，菌液較為澄清；25、37和45 ℃處理組正常生長。37 ℃處理組無菌濾液對沙門氏菌和大腸桿菌K88有抑菌活性(P<0.05)，不抑制金黃色葡萄球菌1882；4、25、45和75 ℃處理組無菌濾液對3種致病菌均無抑菌活性(圖2)。

圖2 不同溫度對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響

2.1.3 不同濃度金屬離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響 不同濃度硫酸銅處理組無菌濾液對大腸桿菌K88、沙門氏菌和金黃葡萄球菌1882均沒有抑制作用。1、2和4 mmol/L鎂離子處理組無菌濾液對大腸桿菌K88的抑菌活性沒有顯著性差異(P>0.05)，且3組均顯著高于0 mmol/L鎂離子處理組(P<0.05)。0、1和2 mmol/L鎂離子處理組對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性沒有顯著性差異(P>0.05)，且3組均顯著高于4 mmol/L鎂離子處理組(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同濃度鎂離子對地衣芽孢桿菌19148抑菌作用的影響

2.2 地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵最適條件探究

2.2.1 不同種子液接種量對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 3%和5%接種量處理組無菌濾液對大腸桿菌K88的抑菌活性顯著高于1%組和7%組(P<0.05)，且3%和5%組之間無顯著差異(P>0.05)，1%、3%和5%接種量處理組無菌濾液對鼠傷寒沙門氏菌的抑菌活性顯著性高于7%組(P<0.05)，且3組間沒有顯著性差異(圖4)。

圖4 不同種子液接種量對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.2.2 不同發(fā)酵時(shí)間對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 28 h處理組無菌濾液對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的抑菌效果顯著高于20、24和32 h處理組(P>0.05)(圖5)。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.2.3 不同搖床轉(zhuǎn)速對地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵的影響 150和200 r/min處理組無菌濾液的抑菌效果顯著高于100、250和300 r/min處理組(P<0.05)，且兩組之間無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖6 不同搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液抑菌作用的影響

2.3 耐藥性評價(jià)

地衣芽孢桿菌19148對27種抗菌藥耐藥性檢測結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌19148對青霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、呋喃唑酮和多黏菌素B 5種抗菌藥表現(xiàn)出中介，對諾氟沙星、氨芐西林、氯霉素等其他22種抗菌藥表現(xiàn)出敏感(表1)。

表1 地衣芽孢桿菌19148 對27種抗菌藥的耐藥性

3 討 論

3.1 地衣芽孢桿菌19148抑菌條件分析

飼用益生菌應(yīng)用于發(fā)酵飼料的生產(chǎn)，首先要具備較強(qiáng)的抗逆性。飼用益生菌需要在高溫加工、低溫冷藏等飼料加工工藝過程中保持益生功能。王芬等[20]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵花生粕，發(fā)現(xiàn)在36 ℃枯草芽孢桿菌的生物活性最高，且隨溫度升高或降低，其活性逐漸下降。苗永美等[21]通過單因素試驗(yàn)探究pH對枯草芽孢桿菌抑菌活性的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)初始pH為5.0時(shí)，菌株發(fā)酵物的抑菌率最高。王曉潔等[22]探究鎂離子濃度對側(cè)孢短芽孢桿菌分泌抗菌脂肽的影響發(fā)現(xiàn)，在13.01 g/L鎂離子發(fā)酵液中抗菌脂肽含量最多。本試驗(yàn)中，地衣芽孢桿菌19148表現(xiàn)出了對外界培養(yǎng)條件良好的耐受性，且菌株抑菌活性的最適培養(yǎng)條件與前人研究一致。

3.2 地衣芽孢桿菌19148體外發(fā)酵最適條件探究

飼用益生菌在不同的發(fā)酵條件下會產(chǎn)生不同的發(fā)酵產(chǎn)物，為降低益生菌發(fā)酵飼料的生產(chǎn)成本，需對其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而提高發(fā)酵效果和益生能力。李光月等[23]利用響應(yīng)面試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌在200 r/min的轉(zhuǎn)速下，表面活性素的產(chǎn)量最大。秦楠等[24]探究了1株解淀粉枯草芽孢桿菌的發(fā)酵特性，結(jié)果表明在接種量3%、發(fā)酵13 h時(shí)，其無菌發(fā)酵濾液的抑菌活性最好。但也有研究指出，枯草芽孢桿菌的最適接種量為1.46%[25]。導(dǎo)致這種差異的主要原因可能是發(fā)酵液營養(yǎng)水平及不同芽孢桿菌菌株生長速率的不同。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在3%接種量、150 r/min發(fā)酵28 h時(shí)，地衣芽孢桿菌19148抑菌活性最好。

3.3 地衣芽孢桿菌19148耐藥性評價(jià)

長久以來，細(xì)菌間獲取和發(fā)展一系列抗生素耐藥機(jī)制一直是益生菌應(yīng)用于畜禽飼料生產(chǎn)的重要阻礙。益生菌產(chǎn)品想要真正替代畜牧業(yè)中促生長類抗生素的使用，不僅自身不能對抗生素表現(xiàn)出耐藥性，且不能使腸道病原菌對益生菌發(fā)揮抑菌活性的途徑產(chǎn)生新的耐藥機(jī)制。由于地衣芽孢桿菌屬細(xì)菌的遺傳相似度很高，很難用遺傳標(biāo)記物進(jìn)行鑒定和分類，而這就需要在菌株水平對地衣芽孢桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測。本研究采用27種不同種類的抗菌藥對地衣芽孢桿菌19148的耐藥性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示除了對多黏菌素B、呋喃唑酮、頭孢他啶、四環(huán)素和青霉素表現(xiàn)為中介外，其余22種抗菌藥均為敏感，因此地衣芽孢桿菌19148不具有抗菌藥耐藥性問題。

4 結(jié) 論

地衣芽孢桿菌191418對外界環(huán)境具有良好的穩(wěn)定性，在pH 6.0、溫度37 ℃、鎂離子濃度為1 mmol/L的培養(yǎng)條件下，其抑菌活性最強(qiáng)。體外發(fā)酵過程中，3%種子液接種量、150 r/min發(fā)酵28 h是其抑菌活性最適發(fā)酵條件。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示地衣芽孢桿菌對27種不同類型的抗菌藥表現(xiàn)為中介或敏感性，不具有耐藥性。