豬鏈球菌臨床分離株對四環(huán)素類抗生素的耐藥性和耐藥基因分析

劉寶玲，楚品品，李春玲，楊冬霞，蔣智勇，張昆麗，宋 帥,勾紅潮，蔡汝健

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州 510225)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，能引起多種疾病，嚴(yán)重時能引起人和豬的死亡，屬于危害較大的傳染性人獸共患病原[1]。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展及抗生素的不規(guī)范使用，豬鏈球菌的耐藥情況日趨嚴(yán)重，對養(yǎng)豬行業(yè)及公共衛(wèi)生造成重大威脅[2]。

四環(huán)素類抗生素是常用的廣譜抗生素，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌的感染,是治療豬鏈球菌病最有效的抗生素之一[3]，2020年之前畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，四環(huán)素常被用作抗菌促生長劑[4-5]。四環(huán)素(tetracycline)、多西環(huán)素(doxycycline)和米諾環(huán)素(minocycline)都是臨床常用四環(huán)素類抗生素，長期使用導(dǎo)致細(xì)菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥性情況嚴(yán)峻。Hoa等[6]報(bào)道1997-2008年間從越南成年人腦脊液中分離的175株豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥性達(dá)到91%，黃文明等[7]報(bào)道了2010-2012年間廣東地區(qū)分離的豬鏈球菌對四環(huán)素類藥物的耐藥率高達(dá)98.2%。

四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制主要為藥物外排和核糖體保護(hù)及滅活或鈍化四環(huán)素酶[8-9]，四環(huán)素耐藥基因多達(dá)四十多種，包括編碼外排泵的基因、編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因及編碼滅活酶的基因[10-13]。細(xì)菌可通過獲得編碼相關(guān)蛋白的耐藥基因產(chǎn)生耐藥性[4,14]，耐藥基因的水平傳播被認(rèn)為是細(xì)菌對抗生素耐藥的重要原因之一[15-16]。四環(huán)素類抗生素對豬鏈球菌耐藥機(jī)制包括：①由tetL、tetB、tetK或tet(40)基因介導(dǎo)的外排泵機(jī)制；②由tetO、tetM、tetS、tetW、tet(O/W/32/O)或tet(O/32/O)基因編碼核糖體保護(hù)蛋白機(jī)制[17]。Chen等[18]分離得到的豬鏈球菌中攜帶的耐藥基因主要為tetM、tetO、tet(O/W/32/O)、tet(O/32/O)、tetS、tetW、tetL、tet(40)；Petrocchi-Rilo等[19]報(bào)道西班牙分離的207株豬鏈球菌中有84.1%的菌株含耐藥基因tetO。

因此，了解細(xì)菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥性及耐藥基因的攜帶情況對疾病的臨床用藥具有十分重要的意義。為了解廣東地區(qū)分離的豬鏈球菌對部分四環(huán)素類抗生素的耐藥情況及耐藥基因的攜帶情況，本研究調(diào)查了近幾年來廣東分離的34株豬鏈球菌對3種臨床常用四環(huán)素類抗生素的耐藥性，并分析了6種四環(huán)素耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX的攜帶情況，以期對臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 2016-2020年從廣東不同地區(qū)分離的豬鏈球菌34株，其中9型鏈球菌19株，2型鏈球菌15株，保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室，菌株具體來源信息如表1所示。

表1 豬鏈球菌菌株來源信息

1.1.2 主要試劑與儀器 四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司)；2×PremixTaq、膠回收試劑盒、DNA提取試劑盒(TaKaRa公司)；新生牛血清(廣州蕊特生物技術(shù)有限公司)。恒溫箱(PYX-DHS500,中國上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZWYR-2101C,中國上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將凍存的細(xì)菌劃線接種于TSA平板上，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至長出單菌落，挑取單個菌落接種于TSB，于37 ℃振蕩培養(yǎng)6 h(本試驗(yàn)所使用的TSB、TSA均加入了5%已滅活的新生牛血清)。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測34株豬鏈球菌對3種四環(huán)素類抗生素的敏感性。取200 μL菌液，用無菌棉拭子均勻涂布在TSA平板上，然后用無菌鑷子夾取藥敏紙片，將其貼在平板表面，將平板放置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑及所使用的藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對藥物的敏感性，判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 K-B試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 參照黃文明等[7]、王學(xué)君等[20]、關(guān)琳等[21]設(shè)計(jì)耐藥基因tetA、tetC、tetD、tetM、tetO、tetX引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息見表3。

表3 引物信息

1.2.4 耐藥基因檢測 將細(xì)菌接種于TSB培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫箱中振蕩培養(yǎng)12 h，收集細(xì)菌，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。用上述6種引物將提取的34株豬鏈球菌的DNA進(jìn)行PCR檢測，將PCR檢測陽性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMix 12.5 μL,DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表3)30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 34株豬鏈球菌對四環(huán)素類抗生素的敏感性檢測結(jié)果

34株豬鏈球菌對四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素的耐藥率見表4。由表4可知，34株豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥率最高，為100%(34/34)，其次為米諾環(huán)素82.4%(28/34)、多西環(huán)素47.1%(16/34)。

表4 豬鏈球菌對四環(huán)素類抗生素的敏感性

2.2 耐藥基因的檢測結(jié)果

34株豬鏈球菌中，tetA、tetC、tetD、tetX基因PCR檢出率均為0；tetO和tetM基因PCR檢出率分別為100%(34/34)和14.7%(5/34)，且5株檢出tetM基因的菌株均為2型。tetO和tetM基因擴(kuò)增片段大小分別為515和406 bp(圖1、2)，與預(yù)期結(jié)果相符，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。

表5 34株豬鏈球菌耐藥基因的攜帶情況

①A，2016-2017年樣品；B，2018-2020年樣品。②M，DL2000 DNA Marker；1～17，樣品；18，陰性對照。圖2同

PCR產(chǎn)物測序所得的核苷酸序列在NCBI上在線BLAST，結(jié)果顯示，與tetO基因核苷酸序列相似性最高的為D16-010262(MT383669.1，99.58%)，與基因tetM核苷酸序列相似性最高的為豬鏈球菌NJ3(CP082203.1，100%)。

圖2 tetM基因的PCR結(jié)果

2.3 34株豬鏈球菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥基因和耐藥表型分析

各菌株的耐藥情況見表6。由表6可知，34株豬鏈球菌至少對1種四環(huán)素類抗生素耐藥，3重耐藥菌株有15株，占比44.1%(15/34)，其中9型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；2重耐藥菌株14株，占比41.1%(14/34)，其中9型豬鏈球菌9株，占比26.5%(9/34)，2型豬鏈球菌5株，占比14.7%(5/34)；只耐1種藥物的5株，占比14.7%(5/34)，5株全部為2型鏈球菌。2或3重耐藥菌株中9型豬鏈球菌為19株，占比55.9%(19/34)，2型豬鏈球菌10株，占比29.4%(10/34)，說明多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高。2重耐藥菌株中耐四環(huán)素和米諾環(huán)素有13株，占比38.2%(13/34)，只有1株菌耐四環(huán)素和多西環(huán)素。

表6 豬鏈球菌耐藥情況統(tǒng)計(jì)

各菌株的耐藥基因攜帶情況見表7。由表7可知，同時攜帶tetO和tetM基因的菌株有5株，占比14.7%(5/34)，這5株菌全部為2型豬鏈球菌；單獨(dú)攜帶tetO基因的菌株有29株，占比85.3%(29/34)。

表7 各菌株的耐藥基因攜帶情況

3 討 論

豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，并帶來嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全[22]。抗生素作為治療豬鏈球菌的首選方法，常在養(yǎng)殖業(yè)中大量使用，但抗生素的廣泛應(yīng)用及不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重，給臨床治療帶來了困難。

四環(huán)素類抗生素是養(yǎng)殖業(yè)最常用的抗生素之一，耐藥情況也較為嚴(yán)峻。Arndt等[23]報(bào)道了加拿大安大略豬場分離的豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥性達(dá)84.2%；Ichikawa等[24]研究發(fā)現(xiàn),日本東海地區(qū)的豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥性為80.7%；Yongkiettrakul等[1]研究報(bào)道泰國不同地區(qū)豬鏈球菌對四環(huán)素類藥物的普遍耐藥。本研究發(fā)現(xiàn)從廣東不同地區(qū)分離得到的34株豬鏈球菌對四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，說明廣東地區(qū)的豬鏈球菌對四環(huán)素類耐藥情況非常嚴(yán)重，僅有多西環(huán)素有較好的治療效果，但其耐藥率也已接近50%，因此臨床用藥時應(yīng)盡量減少或謹(jǐn)慎使用該類抗生素。本研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素類藥物2或3重耐藥較為常見，34株豬鏈球菌中3重耐藥菌株占比達(dá)到44.1%(15/34)，2重耐藥菌株占比41.1%(14/34)，耐1種藥物的菌株占比14.7%(5/34)。本研究中多重耐藥菌株中9型豬鏈球菌比例較高，高達(dá)58.8%(20/34)，說明9型豬鏈球菌更容易造成耐藥，其機(jī)理尚未清楚，需進(jìn)一步驗(yàn)證和研究。

四環(huán)素類抗生素耐藥機(jī)制主要為藥物外排、核糖體保護(hù)及滅活或鈍化四環(huán)素酶等機(jī)制[5]，由不同tet耐藥基因決定。國內(nèi)外對豬鏈球菌四環(huán)素耐藥基因的研究表明，tetO是豬鏈球菌中最常見的耐藥基因[17,25]。Aradanas等[26]研究報(bào)道了2013-2018年間分離的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因?yàn)閠etO。Tan等[27]研究表明，從江西省分離的豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥率較高，且tetO是主要的耐藥基因。本研究對外排泵機(jī)制相關(guān)的基因tetA、tetC和tetD，編碼核糖體保護(hù)蛋白的基因tetM和tetO，編碼滅活酶的基因tetX共6種不同耐藥機(jī)制相關(guān)基因分析發(fā)現(xiàn)，tetA、tetC、tetD、tetM、tetO和tetX基因攜帶率分別為0、0、0、14.7%(5/34)、100%(34/34)和0，說明廣東地區(qū)的豬鏈球菌主要攜帶的耐藥基因?yàn)閠etM和tetO，提示這些豬鏈球菌分離菌株主要通過主動核糖體保護(hù)機(jī)制造成耐藥。不同血清型豬鏈球菌攜帶耐藥基因也存在一定的差異，許曉燕等[28]研究結(jié)果表明，中國大部分地區(qū)的2型豬鏈球菌對四環(huán)素具有很強(qiáng)的耐藥性，主要耐藥機(jī)制是由tetM基因介導(dǎo)的核糖體保護(hù)作用。關(guān)琳等[21]研究報(bào)道了9型豬鏈球菌對四環(huán)素的耐藥主要是由tetO基因介導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)34株鏈球菌都攜帶tetO基因，有5株菌同時攜帶tetO和tetM基因，且發(fā)現(xiàn)這5株豬鏈球菌全部為2型豬鏈球菌，其中機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和探討。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，2016-2020年廣東不同地區(qū)分離的34株豬鏈球菌對四環(huán)素、米諾環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率分別為100%(34/34)、82.4%(28/34)和47.1%(16/34)，2重以上耐藥菌株占比較高。34株豬鏈球菌主要攜帶tetO和tetM基因，其中tetO基因攜帶率為100%，表明分離菌株對四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制與tetO和tetM基因介導(dǎo)的核糖體保護(hù)蛋白有關(guān)。