動物源腸球菌對飼用抗菌促生長劑流行病學臨界值的建立

楊鈺瑩，王少林

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室，廣州 510642)

腸球菌作為一種環(huán)境適應性極強的革蘭陽性球菌，在自然界中分布廣泛，被稱作耐藥基因的“存儲池”，是人類和獸醫(yī)耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)的重要指示菌[1-2]。養(yǎng)殖業(yè)中飼用抗菌促生長劑的廣泛應用是腸球菌產(chǎn)生獲得性耐藥的重要驅(qū)動力，并進一步造成了耐藥菌及耐藥基因向食物鏈傳播，威脅公共衛(wèi)生安全[3]。建立動物源腸球菌對飼用抗菌促生長劑的耐藥判定標準，對2020年中國全面“禁抗”后腸球耐藥表型變化的監(jiān)測具有重要意義。

1986年，由于在動物糞便中檢測到了與人源分離株高度相似的耐萬古霉素腸球菌(VRE)，瑞典、丹麥和瑞士禁止將阿伐他汀作為動物生長促進劑添加使用。1999年，桿菌肽、維吉尼亞霉素和泰樂菌素等在歐洲被列入促生長劑禁用名單。至2006年，歐盟禁用了所有的抗菌促生長劑。此項禁令后，VRE等腸球耐藥菌在動物、食品和人群的檢出率顯著下降。然而，多年后依然能在動物和人類的糞便中檢測到VRE，說明飼用促生長劑對于腸球菌耐藥性發(fā)展具有持久的影響[4]。自20世紀70年代中期，中國逐漸開始將抗菌藥作為動物促生長劑使用[5]。2001年中國農(nóng)業(yè)部168號公告允許吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、那西肽、維吉尼亞霉素、桿菌肽等作為抗菌藥物飼料添加劑在飼料中長期添加使用[6]。此后抗菌促生長劑的廣泛使用尤其是不合理應用加重了細菌耐藥性發(fā)展、耐藥基因出現(xiàn)、生態(tài)環(huán)境污染，以及食品安全問題等[7]。2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號公告規(guī)定藥物促生長添加劑(中藥類除外)在2020年全部退出畜牧養(yǎng)殖業(yè)以遏制動物源細菌耐藥風險[8]。而目前國內(nèi)仍缺乏針對動物源腸球菌對飼用抗菌促生長劑耐藥性的判定標準。

流行病學臨界值(epidemiological cut-off values,ECOFFs)，又稱野生型折點(wild-type cutoff,COWT)，指用于區(qū)分野生型菌株和非野生型菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。流行病學臨界值的確立是耐藥折點制定的第一步，需大量的MIC數(shù)據(jù)支撐，因其主要考察細菌對藥物的敏感性情況，對于監(jiān)測細菌的耐藥表型具有重要意義[9]。

目前建立耐藥折點制定標準的組織主要有美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)與歐洲藥敏試驗委員會(EUCAST)[10]。本研究參考CLST-VET[11]中關(guān)于獸用耐藥性判定標準的制定方法，建立了動物源腸球菌對7種飼用抗菌促生長劑的流行病學臨界值，以期填補國內(nèi)腸球菌對飼用抗菌促生長劑流行病學臨界值的研究空白，對開展腸球菌耐藥表型的監(jiān)測具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司)；腸球菌屬顯色培養(yǎng)基(疊氮納-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂)、檸檬酸鐵銨、腦心浸液(BHI)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責任公司)；革蘭陽性需氧菌藥敏檢測板(促生長藥敏檢測系列，上海星佰生物技術(shù)有限公司)；標準質(zhì)控腸球菌(Enterococcusfaecalis,ATCC 29212)。

1.2 方法

1.2.1 動物源腸球菌的分離、鑒定與保存 2019-2021年從北京、河北、四川、山西、陜西和內(nèi)蒙古養(yǎng)殖場采集動物直腸/泄殖腔拭子630份、腸道內(nèi)容物473份，接種腸球菌屬顯色培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h。觀察菌落形態(tài)。挑取單個可疑腸球菌菌落，接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24～48 h進一步純化。取純化菌，均勻涂布于靶板樣品孔中，晾干，加基質(zhì)溶液1 μL，混勻，晾干，待測。將樣品靶板放置于質(zhì)譜儀樣品靶板槽，采集數(shù)據(jù)并處理。將采集的樣品數(shù)據(jù)圖譜與數(shù)據(jù)庫中標準菌株的數(shù)據(jù)圖譜比對，得到相似度數(shù)值，鑒定分值達種水平可信即可判斷。將質(zhì)譜鑒定為腸球菌的新鮮純化菌，加無菌生理鹽水制成菌懸液，與滅菌甘油溶液混合，使甘油終濃度為20%～40%，-80 ℃保存。

1.2.2 MIC測定 將分離保存的腸球菌進行至少2次的復蘇轉(zhuǎn)種。傳代后，挑取菌落數(shù)個，置2～3 mL滅菌生理鹽水中，用0.5麥氏比濁管進行比濁，調(diào)制菌液濃度為1.5×108CFU/mL左右。取上述菌液60 μL，滴入無菌加樣槽中，加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液1支(12 mL)混勻。用微量移液器吸取稀釋菌液100 μL，加入96孔微量藥敏板(H12陰性對照孔除外)。將板條放入恒溫培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)18～20 h。自培養(yǎng)箱中取出板條，用干毛巾輕輕擦拭板條底部。肉眼判讀各個孔的陰陽性結(jié)果，混濁為陽性，清晰為陰性。

1.2.3 流行病學臨界值的建立 將測定的MIC數(shù)據(jù)輸入統(tǒng)計軟件ECOFFinder XL2010 v 2.0[12]中，繪制出MIC原始數(shù)據(jù)分布直方圖及原始MIC分布數(shù)據(jù)趨勢線，采用非線性回歸分析法擬合MIC累計分布，在最佳擬合范圍內(nèi)確定在不同置信區(qū)間的流行病學臨界值。取置信區(qū)間為95%的流行病學臨界值進行耐藥率計算。

2 結(jié) 果

2.1 MIC分布

本研究測定了2019-2021年分離自不同省市養(yǎng)殖場的腸球菌對7種飼用抗菌促生長劑的MIC值，針對阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽和維吉尼亞霉素的分別為787、662、585、697、160和797株(表1)。

表1 2019-2021年分離自不同省市養(yǎng)殖場且測定MIC值的腸球菌

將測得的MIC數(shù)據(jù)分別進行統(tǒng)計分析，由圖1可知，動物源腸球菌對阿維拉霉素的MIC分布范圍在0.25～64 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對恩拉霉素的MIC分布范圍在0.5～16 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對桿菌肽的MIC分布范圍在2～256 μg/mL，最多分布在8 μg/mL；對黃霉素的MIC分布范圍在1～512 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對吉他霉素的MIC分布范圍在1～16 μg/mL，最多分布在2 μg/mL；對那西肽的MIC分布范圍在0.016～0.5 μg/mL，最多分布在0.06 μg/mL；對維吉尼亞霉素的MIC分布范圍在0.25～64 μg/mL，最多分布在8 μg/mL。其中，MIC數(shù)據(jù)分布最廣的為黃霉素，其次為維吉尼亞霉素和阿維拉霉素。

A，阿維拉霉素；B，恩拉霉素；C，桿菌肽；D，黃霉素；E，吉他霉素；F，那西肽；G，維吉尼亞霉素

2.2 流行病學臨界值的確立

對7種抗菌促生長劑的MIC分布數(shù)據(jù)分別進行非線性回歸擬合，擬合線呈對數(shù)正態(tài)分布，不同置信區(qū)間下的流行病學臨界值見表2。不同置信區(qū)間下得到的流行病學臨界值存在差異，在95.00%置信區(qū)間下，動物源腸球菌對阿維拉霉素、恩拉霉素、黃霉素、吉他霉素、維吉尼亞霉素的流行病學臨界值都為8 μg/mL；對桿菌肽的流行病學臨界值為32 μg/mL；對那西肽的流行病學臨界值為0.25 μg/mL。由此制定的動物源腸球菌對阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽、維吉尼亞霉素的流行病學臨界值分別為8、8、32、8、8、0.25和8 μg/mL。

表2 動物源腸球菌對抗菌促生長劑在不同置信區(qū)間下的流行病學臨界值

2.3 耐藥率

以95%置信區(qū)間下的流行病學臨界值計算動物源腸球菌對7種抗菌促生長劑的耐藥率。所有菌株對7種抗菌促生長劑的耐藥率見表3。由表3可知，動物源腸球菌對恩拉霉素(多肽類)的耐藥率最高，達到80.06%；其次是吉他霉素(大環(huán)內(nèi)酯類)，為64.38%；維吉尼亞霉素(鏈陽性菌素)為50.69%；對黃霉素(多糖類)、桿菌肽(多肽類)、阿維拉霉素(寡聚糖類)和那西肽(多肽類)的耐藥率相對較低，分別為34.43%、24.96%、19.06%和14.69%，表明近年來動物源腸球菌對恩拉霉素、吉他霉素和維吉尼亞霉素的耐藥情況相對更為嚴重。2019-2021年動物源腸球菌對7種抗菌促生長劑的耐藥率變化見圖2。由圖2可知，動物源腸球菌對黃霉素的耐藥率在2019-2021年有較大幅度的下降，對桿菌肽的耐藥率有較小幅度的降低，而對于其他抗菌促生長藥物的耐藥率都有不同程度的上升。

表3 95%置信區(qū)間下動物源腸球菌對抗菌促生長劑的耐藥率

圖2 95%置信區(qū)間下2019—2021年動物源腸球菌對抗菌促生長劑的耐藥率變化

3 討 論

中國作為畜禽養(yǎng)殖大國，是全球獸用化學制劑使用量最大的國家之一。獸用抗菌藥按用途一般可分為治療和促生長兩大類。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計，促生長作用的獸用抗菌藥用量在近年來已占到了抗菌藥總用量的近一半[13]?？咕幬镌陲暳系奶砑邮褂迷诜乐蝿游镆卟　⑻岣唣B(yǎng)殖效益方面發(fā)揮了極大作用，但同時也加速了動物源細菌耐藥性的發(fā)展，威脅公共衛(wèi)生安全。本研究包括的7種抗生素屬于2001年農(nóng)業(yè)部公告批準在飼料中長期添加的抗菌藥物，已在畜牧養(yǎng)殖業(yè)應用了近20年，2020年7月開始被禁止使用。

本研究結(jié)果顯示，動物源腸球菌對阿維拉霉素、恩拉霉素、桿菌肽、黃霉素、吉他霉素、那西肽、維吉尼亞霉素的流行病學臨界值分別為8、8、32、8、8、0.25和8 μg/mL。在這幾種藥物中，動物源腸球菌對桿菌肽的流行病學臨界值最高，為32 μg/mL，表明目前其耐藥水平較高。桿菌肽是一種多肽類抗生素，可治療革蘭陽性菌引起的局部感染，介導桿菌肽耐藥的主要為耐藥基因簇bcrRABD，目前對于bcrRABD基因簇在動物源腸球菌中流行情況的研究仍相對缺乏[14]。已有研究表明，bcrRABD基因簇可通過腸球菌的克隆傳播，質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移及ISEnfa1形成的轉(zhuǎn)移元件在腸球菌之間擴散[15]。動物源腸球菌對那西肽的流行病學臨界值僅為0.25 μg/mL，表明腸球菌對那西肽非常敏感。這可能是由于那西肽是一種較為新型的飼料添加劑，由于產(chǎn)量不高的問題在中國發(fā)展應用的時間較晚[16]。

維吉尼霉素與新型人類抗菌藥Synercid都屬于鏈陽性菌素，Synercid可治療VRE引起的感染，被認為是臨床最有應用前景的抗生素之一[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Synercid投入臨床使用前后均在臨床和畜禽源腸球菌中分離到了相同的抗性質(zhì)粒(satA)和抗性基因(vatD,vatE)，研究認為維吉尼霉素對動物的選擇壓力很可能是引起人Synercid耐藥現(xiàn)象的直接原因[18-20]。阿維拉霉素是一種寡聚糖類抗生素，目前推測能與人用抗生素Ziracin產(chǎn)生交叉耐藥性。Ziracin對各種革蘭陽性菌的抗菌活性高于萬古霉素及奎奴普丁-達福普汀，是一種重要的臨床藥物[21]。本研究結(jié)果顯示，動物源腸球菌對維吉尼亞霉素的耐藥率較高，為50.69%，對阿維拉霉素的耐藥率為19.06%，這需引起警惕。

桿菌肽、阿維拉霉素和黃霉素在此前多個報道中均被發(fā)現(xiàn)對畜禽動物腸道菌群具有較大的選擇壓力[22-23]。本研究動物源腸球菌對黃霉素、桿菌肽和阿維拉霉素的耐藥率分別為34.43%、24.96%和19.06%，需進一步追蹤禁用這些藥物后耐藥性及相關(guān)耐藥基因的情況。動物源腸球菌對恩拉霉素和吉他霉素的耐藥率在本研究中表現(xiàn)最高，但其耐藥情況在國內(nèi)外均少有報道，未來需要更多的關(guān)注和研究。

在近幾年中國促生長獸用抗菌藥使用統(tǒng)計中，用量占比從高到低分別為桿菌肽、吉他霉素、維吉尼亞霉素、恩拉霉素、黃霉素、那西肽、阿維拉霉素，尤其集中在前5種藥物[24-25]。本研究中，動物源腸球菌對使用量最少的那西肽和阿維拉霉素的耐藥率也最低(19.06%和14.69%)。在2020年的促生長獸用抗菌藥物統(tǒng)計中，桿菌肽的使用量比之2019年下降了50%以上，黃霉素、吉他霉素和恩拉霉素的使用量下降了80%以上[13，25]，但在2019-2021年的耐藥率變化情況統(tǒng)計中，除了黃霉素和桿菌肽，其他抗菌藥物的耐藥率依然呈上升趨勢。主要原因可能是監(jiān)測時間較短及每年監(jiān)測涉及的養(yǎng)殖場具有一定差異性。因此有必要持續(xù)監(jiān)測，同時擴大監(jiān)測的范圍，使監(jiān)測情況更全面準確。

4 結(jié) 論

本研究根據(jù)2019-2021年采集自6個省市養(yǎng)殖場的近800株腸球菌的MIC數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析得出了動物源腸球菌對吉他霉素、黃霉素、恩拉霉素、那西肽、阿維拉霉素、維吉尼亞霉素和桿菌肽的流行病學臨界值分別為8、8、8、0.25、8、8和32 μg/mL。本研究建立了腸球菌對飼用抗菌促生長劑耐藥情況的初步判定標準，為進一步制定耐藥折點，監(jiān)測“禁抗”前后腸球菌對抗菌促生長劑的耐藥率變化提供了參考。