酸菜中乳酸菌生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)酸性能及抑菌性能探究

袁先鈴，周鶯茹，鄭連強(qiáng)，雷鳴，王俊丁

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川省遠(yuǎn)達(dá)集團(tuán)富順縣美樂(lè)食品有限公司，四川 自貢 643200）

四川酸菜主要是以芥菜為加工原料，通過(guò)優(yōu)勢(shì)菌群乳酸菌以厭氧為主發(fā)酵而成的一種發(fā)酵類食品[1]，是一種佐餐菜肴，也是一種輔料[2]。乳酸菌從來(lái)源上可分為動(dòng)物源乳酸菌和植物源乳酸菌[3]，從發(fā)酵過(guò)程上可分為異型乳酸發(fā)酵菌和同型乳酸發(fā)酵菌[4]。乳酸菌能在酸性較強(qiáng)的條件下生長(zhǎng)并能在鹽水濃度較高的環(huán)境中繁殖，但乳酸菌本身只有肽酶，合成氨基酸、核酸、維生素的能力極低，所以在乳酸菌的生長(zhǎng)環(huán)境中需要加入氨基酸、維生素等生長(zhǎng)因子[5]。楊靜等[6]研究得出植物乳桿菌在恒溫培養(yǎng)6 h～8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。類干酪乳桿菌在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，發(fā)酵30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期[7]。比較菌株的生長(zhǎng)速率和產(chǎn)酸量可以反映乳酸菌的發(fā)酵性能[8]，羅強(qiáng)等[9]從自然發(fā)酵泡菜中篩選出9株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株。乳酸菌可以分泌多種抑菌物質(zhì)，主要包括有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等[10]。乳酸菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，而有機(jī)酸的存在會(huì)導(dǎo)致環(huán)境pH值降低，進(jìn)而抑制腐敗菌的生長(zhǎng)[11]。郝湘妹[12]研究抑制霉菌乳酸菌的篩選、特性及應(yīng)用時(shí)，發(fā)現(xiàn)pH值為中性的發(fā)酵上清液的抑菌活性顯著下降（p＜0.05）。

發(fā)酵菌株的產(chǎn)酸性能和抑菌性能對(duì)酸菜的風(fēng)味有重要影響。從溫度和含鹽量?jī)蓚€(gè)方面探究對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，通過(guò)探究乳酸菌發(fā)酵液在32 h內(nèi)的pH值變化規(guī)律篩選出產(chǎn)酸速率最快的菌株，采用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選出對(duì)不同指示菌抑制效果比較好的菌株，以期獲得理想的人工接種乳酸菌菌株，從而顯著縮短酸菜發(fā)酵周期，改善酸菜的品質(zhì)[13-14]，為實(shí)現(xiàn)高品質(zhì)規(guī)?；I(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標(biāo)菌（食品乳桿菌、植物乳桿菌、類干酪乳桿菌菌株）：從自然發(fā)酵酸菜中分離所得；指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌）：北京保藏生物科技有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g、酵母膏0.5 g、牛肉膏1.0 g、磷酸氫二鉀0.2 g、檸檬酸二銨0.2 g、乙酸鈉0.2g、葡萄糖2.0g、吐溫80 0.1mL、MnSO4·4H2O 0.025g、MgSO4·7H2O 0.058 g、蒸餾水 100 mL，pH6.2～6.4[5]。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 15 g～25 g、水 1 000 mL、pH7.4～7.6。

LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂粉 15 g、pH7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-250E生化培養(yǎng)箱：上海培因試驗(yàn)儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Legend Micro17離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；PHS-3C pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生長(zhǎng)趨勢(shì)的測(cè)定

選擇3種目標(biāo)菌分別在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并將2%的相應(yīng)菌液接種到MRS液體培養(yǎng)基中。將菌液置于37℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)52 h，每隔4 h測(cè)定1次菌液在600 nm處的吸光度，平行測(cè)定3次。

1.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以2%的接種量將菌液接種于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別在 20、23、26、29、32、35、38 ℃培養(yǎng) 24 h，并在600 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次[15]。

1.3.3 含鹽量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

以2%的接種量將菌液接種于NaCl濃度分別為0%、2%、4%、6%、8%和10%的MRS液體培養(yǎng)基中，于35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并在600 nm處測(cè)定吸光度，平行測(cè)定3次[15]。

1.3.4 乳酸菌的產(chǎn)酸性能測(cè)定

以2%的接種量將3株菌株接入到裝有2 mL MRS液體培養(yǎng)基的離心管中 37 ℃培養(yǎng) 0、8、16、24、32 h，分別測(cè)發(fā)酵液pH值，每株菌平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值[16]。

1.3.5 乳酸菌的抑菌性能研究

指示菌以金黃色葡萄球菌為例，大腸桿菌和沙門氏菌試驗(yàn)方法參照金黃色葡萄球菌。配制固體金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基，121℃滅菌15 min后取出倒平板，待凝固后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

金黃色葡萄球菌菌懸液的配制：將金黃色葡萄球菌接種于滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，放置在37℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出放入4℃冰箱備用。

將2%的食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌3株菌的發(fā)酵液接種培養(yǎng)24 h后于4℃，12 000 r/min離心10 min，取發(fā)酵上清液4℃保存?zhèn)溆?。?00 μL稀釋后的指示菌液于相應(yīng)的指示菌培養(yǎng)基上并均勻涂布在平板表面，輕輕放上牛津杯（牛津杯既不能集中放，也不能放在平板的邊緣，均勻放置）；用移液槍向牛津杯中加入100 μL發(fā)酵上清液，對(duì)照用不加菌株的空白發(fā)酵液。放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察抑菌圈大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小，每株菌平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，比較3株菌的抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的繪制

2.1.1 菌株生長(zhǎng)曲線

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1 菌株生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curves of strains

由圖1可知，食品乳桿菌在12 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在36 h后進(jìn)入衰亡期；植物乳桿菌在8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在44 h后進(jìn)入衰亡期；類干酪乳桿菌在8 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在40 h后進(jìn)入衰亡期。由此可見，植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的對(duì)數(shù)期比食品乳桿菌的對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期更長(zhǎng)，更適合作為酸菜添加菌株。

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株生長(zhǎng)的影響如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth of strain

溫度通過(guò)影響乳酸菌細(xì)胞中酶的活性，從而影響乳酸菌菌株的生長(zhǎng)。由圖2可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，乳酸菌生長(zhǎng)得越好，均在35℃時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)最佳；但當(dāng)培養(yǎng)溫度超過(guò)35℃時(shí)，3株菌的生長(zhǎng)均受到了抑制。Dong等[17]對(duì)乳酸菌株篩選研究表明溫度越高，乳酸菌細(xì)胞數(shù)量和乳酸產(chǎn)量越大，但在32℃～35℃時(shí)生長(zhǎng)最好，乳酸產(chǎn)量最高，并且隨著溫度繼續(xù)升高，生長(zhǎng)繁殖受到抑制，乳酸產(chǎn)量下降。

2.1.3 菌株耐鹽試驗(yàn)

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株耐鹽試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 菌株耐鹽試驗(yàn)Fig.3 Salt tolerance test of strain

由圖3可知，隨著含鹽量的增加，3株菌的生長(zhǎng)繁殖均受到了抑制，在低濃度時(shí)，抑制作用不明顯，而在高濃度時(shí)幾乎不生長(zhǎng)，綜合發(fā)酵酸菜需要一定含鹽量的情況，含鹽量控制在0%～8%時(shí)，乳酸菌的活性最好。黃海欽等[18]發(fā)明一種老壇酸菜的加工工藝方法，其酸菜含鹽量為7%～9%時(shí)比自然發(fā)酵工藝腌制出來(lái)的酸菜酸度更為明顯，風(fēng)味更佳，食用口感更好。

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸性能

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株的發(fā)酵液在0～32 h內(nèi)的pH值變化如圖4所示。

圖4 乳酸菌發(fā)酵液pH值變化Fig.4 pH levels of fermentation broth of lactic acid bacteria

由圖4可以得出，3株菌株發(fā)酵液的pH值整體變化呈下降趨勢(shì)。在0～8 h之間pH值下降速度最快，此時(shí)3株菌在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期代謝旺盛，產(chǎn)酸速率最快，8 h～24 h之間pH值下降速度減緩，此時(shí)部分乳酸菌菌株已進(jìn)入穩(wěn)定期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變少，24 h～32 h之間pH值下降更慢，這是因?yàn)榇蟛糠秩樗峋堰M(jìn)入穩(wěn)定期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本消耗殆盡，酸類等代謝產(chǎn)物大量累積，這在一定程度上又抑制了酸的形成。0～24 h之間pH值下降速率最快的菌株是植物乳桿菌，其中植物乳桿菌和類干酪乳桿菌發(fā)酵液24 h后的pH值最低，分別為3.23和3.24，pH值下降速率最快。因此植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的產(chǎn)酸能力最強(qiáng)。菌株的產(chǎn)酸能力越強(qiáng)，加入到酸菜進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間越短。綜上，選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為添加菌株。

2.3 乳酸菌的抑菌性能結(jié)果

食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌菌株對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌3種指示菌的抑菌效果如圖5所示。

圖5 乳酸菌對(duì)指示菌抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of lactic acid bacteria on indicator bacteria

如圖5所示，3株乳酸菌抑制大腸桿菌效果大小順序：植物乳桿菌＞類干酪乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑分別為16、15、12 mm；對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌效果大小順序：植物乳桿菌＞類干酪乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑為17、14、13 mm。對(duì)沙門氏菌抑菌效果大小順序：類干酪乳桿菌＞植物乳桿菌＞食品乳桿菌，抑菌圈直徑為20、18、14 mm。從數(shù)據(jù)分析得出同一指示菌對(duì)不同乳酸菌的抑制效果不相同，這和趙媛媛[16]研究乳酸菌對(duì)不同指示菌的抑制的結(jié)果相符。其次，植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑幾乎都在16 mm～18 mm；從這一數(shù)據(jù)可以得出：同一菌株對(duì)不同指示菌的抑制效果不同[19]。指示菌有陽(yáng)性菌和陰性菌，而3株乳酸菌株都是陽(yáng)性菌株，一般來(lái)說(shuō)，大多數(shù)乳酸菌僅僅抑制親緣關(guān)系相近的菌種或多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[20]，也有研究表明，陽(yáng)性菌株對(duì)陽(yáng)性指示菌的抑制作用大于對(duì)陰性指示菌的抑制作用。所以植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果好于對(duì)沙門氏菌。

植物乳桿菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，如陸春波等[21]確定了植物乳桿菌對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有較強(qiáng)的抑制作用；Dong等[17]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)乙酸、乳酸和丙酸等有機(jī)酸。植物乳桿菌能產(chǎn)生植物乳桿菌素，該細(xì)菌素在pH值較低的酸性環(huán)境中有較強(qiáng)的抑菌活性，高壓處理其發(fā)酵上清液后仍保持良好的抑菌活性[12]。植物乳桿菌具有抑菌作用，酸菜中添加植物乳桿菌就能增加酸菜中抑菌物質(zhì)含量，而酸菜中含有的乳酸、乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸有助于酸菜的抑菌性能。

綜上所述，對(duì)3種指示菌抑制效果均比較好的菌株是植物乳桿菌和類干酪乳桿菌。這兩株乳酸菌對(duì)3種指示菌都具有良好的抑菌能力，同時(shí)這兩株菌能有效改善酸菜的腐敗，對(duì)酸菜的風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要意義。由此，選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為發(fā)酵酸菜的優(yōu)良菌株。

3 結(jié)論

對(duì)食品乳桿菌、植物乳桿菌和類干酪乳桿菌這3株乳酸菌，進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株菌的pH值均呈下降趨勢(shì)，但植物乳桿菌和類干酪乳桿菌的pH值較食品乳桿菌低，所以選擇植物乳桿菌和類干酪乳桿菌作為pH值下降快、產(chǎn)酸速率高的菌株。通過(guò)抑菌特性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和類干酪乳桿菌對(duì)3種指示菌的抑菌圈直徑均大于食品乳桿菌，認(rèn)為這兩株菌抑菌能力較好。綜合產(chǎn)酸特性和抑菌特性，篩選植物乳桿菌和類干酪乳桿菌兩株菌作為人工添加菌株，可進(jìn)行深入研究。但本研究針對(duì)的是常見3種腐敗菌和致病菌，下一步可以增加指示菌的種類，對(duì)乳酸菌抑制腐敗菌和致病菌的物質(zhì)和原理進(jìn)行深入探究。