產(chǎn)芽孢菌調(diào)控五羥色胺促進(jìn)胃腸動(dòng)力的機(jī)制研究

黃薏佳，陳燕敏，陳豐連，王術(shù)玲

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

功能性胃腸疾病包括腸易激綜合征、功能性消化不良、慢傳輸性便秘等多種消化疾病，主要體現(xiàn)為胃腸的運(yùn)動(dòng)與分泌機(jī)能失調(diào)、無組織學(xué)器質(zhì)性病理改變的胃腸道功能紊亂[1-2]。目前已有眾多相關(guān)研究表明，功能性胃腸疾病與腸道菌群的失調(diào)密切相關(guān)[3-4]，該類疾病的腸道菌群紊亂主要體現(xiàn)在瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）、多爾氏菌屬（Dorea）、大腸桿菌（Escherichia coli）、鏈球菌（Streptococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）以及乳桿菌屬（Lactobacillus）等的豐度異常改變[5-6]，其中發(fā)生變化的多數(shù)菌屬均屬于產(chǎn)芽孢菌（spore-forming microbes，Sp.）。產(chǎn)芽孢菌作為腸道菌群的重要組成部分在近年來的研究中受到了廣泛關(guān)注，出現(xiàn)了越來越多關(guān)于產(chǎn)芽孢菌的研究與應(yīng)用，其中包括食物與藥品領(lǐng)域的相關(guān)研究。在益生菌發(fā)酵豆奶酸奶的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)芽孢菌中部分益生菌如凝結(jié)芽孢桿菌等被用于酸奶的發(fā)酵以提高酸奶品質(zhì)[7-8]。而在臨床藥品應(yīng)用上發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌活菌膠囊配合莫沙必利可以有效治療功能性便秘[9]，凝結(jié)芽孢桿菌也被證實(shí)對(duì)于胃腸道疾病有治療作用，已被制成凝結(jié)芽孢桿菌活菌片應(yīng)用于臨床[10]。通過前期文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果推測(cè)產(chǎn)芽孢菌可能與功能性胃腸疾病的胃腸運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)密切相關(guān)。本研究選擇以偽無菌（pseudo-germfree，PGF）小鼠為研究對(duì)象，通過體外提取產(chǎn)芽孢菌進(jìn)行小鼠體內(nèi)定殖，探討產(chǎn)芽孢菌能否調(diào)節(jié)小鼠胃腸動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)功能，并進(jìn)一步研究其潛在的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康C57BL/6J雄性小鼠[（20±2）g，SPF級(jí)]：珠海百試通生物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（粵）2020-0051。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)獲得了廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。動(dòng)物飼養(yǎng)在恒溫環(huán)境（23±1）℃，12 h明暗交替下，自由飲食飲水，定時(shí)更換小鼠墊料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前，根據(jù)體質(zhì)量和隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分為偽無菌小鼠組（PGF組）和產(chǎn)芽孢菌定殖鼠組（PGF+Sp.組），每組 6只。

1.2 試劑

TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNase H Plus）試劑盒：TaKaRa公司；糞便基因組DNA提取試劑盒D2700：北京索萊寶科技有限公司；氨芐青霉素（98%）、硫酸新霉素（美國(guó)藥典級(jí)）、甲硝唑（99%）、萬古霉素（≥900μg/mg，V2002）：上海麥克林生化科技有限公司；2×TransTaqR-T PCR SuperMix（-dye）、Trans2KRDNA Marker：北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯仿：天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚紅：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；厭氧培養(yǎng)基（gifu anaerobic medium，GAM，HB8518）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（HB0177-1）：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Sub-Cell GT1704484水平式核酸電泳儀：美國(guó)BIO-RAD公司；6460三重四極桿質(zhì)譜儀、1260液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；ABI7500熒光定量PCR儀：美國(guó)Applied Biosystems公司；JXFSTPRP-CL全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；NanoDrop ND-2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀：賽默飛世爾科技公司；HYQX-I厭氧培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)儀器有限公司；TGL-16R冷凍高速離心機(jī)：黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 PGF小鼠模型建立及評(píng)價(jià)

1.4.1.1 混合抗生素溶液的配制

取抗生素適量，配制成含0.5 g/L萬古霉素及氨芐青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑各1 g/L的混合水溶液。

1.4.1.2 PGF小鼠模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，設(shè)定小鼠單位給藥劑量為0.2 mL/10 g，每天灌胃混合抗生素溶液兩次，連續(xù)給藥12 d，期間將飲用水換成混合抗生素溶液，以無菌飼料飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.4.1.3 PGF小鼠模型評(píng)價(jià)

每日定時(shí)收集小鼠糞便，置于-80℃保存。參照文獻(xiàn)[11-12]，選擇糞便懸液涂板法和腸桿菌基因間保守重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences-polymerase chain reaction，ERIC-PCR）法對(duì)PGF小鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。

涂板法：取0.1 g小鼠糞便于0.9 mL生理鹽水中振蕩混勻，用三層紗布過濾，得糞便菌懸液，稀釋為10-4濃度，分別涂布于GAM固體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，前者置于厭氧培養(yǎng)箱，后者置于37℃培養(yǎng)箱，分別倒置培養(yǎng)2 d后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

ERIC-PCR法：取小鼠糞便，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細(xì)菌總DNA。以Versalovic等[13]設(shè)計(jì)的 ERIC-PCR 引物（上游 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，下游 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′）對(duì)糞便中的細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：細(xì)菌總 DNA 2 μL（50 ng）、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 8.5 μL，總體積 25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性 1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸3 min（35個(gè)循環(huán)）；72℃終延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加入1 μL上樣緩沖液，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（100 V、40 min；75 V、100 min）后，取膠塊于凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。條帶識(shí)別由天能凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行處理。

1.4.2 產(chǎn)芽孢菌的提取、驗(yàn)證及定殖

參照文獻(xiàn)[14]，本實(shí)驗(yàn)采用氯仿提取法提取產(chǎn)芽孢菌菌液。收集3名健康志愿者的新鮮糞便，志愿者3個(gè)月內(nèi)未接受抗生素治療，取樣前未攝入益生元或益生素，并且無腸道疾病史，收集過程盡量保持無菌狀態(tài)，樣本于-80℃保存。提取前在4℃下解凍糞便樣本，將不同志愿者的糞便混合均勻，稱取糞便樣本3 g于50 mL離心管內(nèi)，在超凈臺(tái)中加入30 mL無菌的L-半胱氨酸鹽酸鹽預(yù)還原磷酸緩沖鹽溶液，渦旋混合后加入3%氯仿，混合均勻，并在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育2 h。孵育結(jié)束后，用三層紗布過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至新試管中，通入二氧化碳?xì)怏w以去除氯仿，得產(chǎn)芽孢菌菌液。取產(chǎn)芽孢菌菌液和糞便菌懸液各3 mL，4 000 r/min離心10 min，保留沉淀菌體，按照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書，提取細(xì)菌總DNA。

根據(jù)產(chǎn)芽孢菌常見菌屬（Clostridium、Ruminococcus、扭鏈瘤胃球菌屬（Ruminococcus_torques_group）、Dorea）設(shè)計(jì)引物，并選擇非產(chǎn)芽孢菌菌屬（Lactobacillus和Bacteroides）作為陰性對(duì)照，取產(chǎn)芽孢菌菌液及糞便菌懸液DNA進(jìn)行菌屬聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗(yàn)證鑒定。反應(yīng)體系：菌液DNA 1 μL、2× EasyTaq PCR SuperMix（-dye）12.5 μL、上游引物 F 1 μL、下游引物 R 1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積25 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序設(shè)置：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 10 s，30個(gè)循環(huán)；72℃保持 10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1 μL的上樣緩沖液，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（110 V，45 min）后，取膠塊于凝膠成像儀進(jìn)行成像分析。

PGF造模后的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組，偽無菌小鼠組（PGF組）和產(chǎn)芽孢菌定殖組（PGF+Sp.組），每組6只，PGF+Sp.組按照0.1 mL/10 g的劑量灌胃給予產(chǎn)芽孢菌菌液，持續(xù)給菌兩周，PGF組灌胃同體積磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。收集小鼠糞便，提取細(xì)菌總DNA，通過熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)方法（quantitative polymerase chain reaction detecting system，qPCR）檢測(cè)產(chǎn)芽孢菌定殖情況。按照SYBR GreenRPro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒操作說明，在7500 Real Time PCR System進(jìn)行qPCR反應(yīng)，并按照儀器默認(rèn)程序進(jìn)行熔解曲線的繪制，評(píng)價(jià)反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。

取測(cè)量平均擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）值做數(shù)據(jù)分析。常用管家基因16S rRNA用作內(nèi)參基因來標(biāo)定目標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)。目標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCT法。測(cè)定的目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。

表1 測(cè)定菌屬表達(dá)所用基因引物序列Table 1 Gene primers used to determine the expression of bacteria

1.4.3 小腸推進(jìn)率與胃殘留率測(cè)定

小鼠末次給菌定殖后需禁食不禁水24 h，解剖前20 min，以0.1 mL/10 g灌胃體積給小鼠灌胃0.002 g/mL苯酚紅溶液。

1.4.3.1 小腸推進(jìn)率測(cè)定

沿腹部中線剪開皮膚，用棉簽將腹部腸道脂肪清理干凈以免影響觀測(cè)，暴露胃組織后剪取胃及小腸。取幽門至回盲部的完整小腸輕輕平鋪于解剖板上，測(cè)量全長(zhǎng)。觀察苯酚紅推進(jìn)的最終位置，測(cè)量其到幽門的距離?？山柚渭舆m量的0.1 mol/L NaOH溶液是否變?yōu)樽仙珌砼袛啾椒蛹t推進(jìn)位置，測(cè)量最終位置到胃幽門的長(zhǎng)度，作為苯酚紅推進(jìn)的距離。小腸推進(jìn)率的計(jì)算公式如下。

1.4.3.2 胃殘留率測(cè)定

吸取0.75mL苯酚紅溶液（0.002g/mL）加入0.1mol/L NaOH溶液定容至25 mL，上下顛倒混勻后，精密量取0.050、0.225、0.500、0.725、0.950、1.175 mL 混合溶液并分別加入純水定容至10 mL，即得各系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液于560 nm處吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密量取NaOH溶液（0.1 mol/L）10 mL置于表面皿中，將胃組織浸于NaOH溶液中并沿胃大彎剪開，將胃組織內(nèi)容物充分洗滌，收集洗滌溶液并上下顛倒混勻，室溫下5 000 r/min離心15 min，吸取上清液2 mL并用純水定容至10 mL，充分混勻后，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度（測(cè)定波長(zhǎng)為560 nm），即為測(cè)定液OD值。胃殘留率的計(jì)算公式如下。

1.4.4 液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)結(jié)腸和血漿中五羥色胺、色氨酸（tryptophan，TRP）的含量

采用液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer，LC-MS/MS）[17]檢測(cè) 5-HT、TRP的含量。取50μL血漿加入5μL9μg/mL茶堿溶液和200μL預(yù)冷乙腈，稱取約20mg結(jié)腸組織加入9倍量生理鹽水勻漿，勻漿液加入5μL內(nèi)標(biāo)和800μL預(yù)冷乙腈。渦旋1min后，離心（4℃，14000r/min，15min），取上清液氮吹干燥，以100 μL流動(dòng)相（0.1%甲酸-水）復(fù)溶。

色譜條件：Waters XSelect HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；溫度 30℃；流動(dòng)相 A 為 0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；流速0.2 mL/min；梯度洗脫條件如表2所示。

表2 LC-MS/MS梯度洗脫條件Table 2 LC-MS/MS Gradient elution condition

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；離子源溫度300℃；錐孔氣為氮?dú)猓魉贋? L/min，去溶劑氣為氮?dú)?，流速?1 L/min。其中去溶劑氣溫度為300℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；正離子模式下毛細(xì)管電壓為3 500 V，噴嘴電壓為500 V。

1.4.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-qPCR）測(cè)定結(jié)腸色氨酸羥化酶 1（tryptophan Hydroxylase 1，TPH1）mRNA 表達(dá)

取20 mg結(jié)腸組織提取總RNA，以磁珠研磨法在全自動(dòng)勻漿機(jī)中勻漿（60 Hz，120 s），離心抽提結(jié)腸組織中總RNA，用無酶水復(fù)溶。采用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行去gDNA反應(yīng)后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄成功后的cDNA置于-20℃冰箱保存待測(cè)。

RT-qPCR反應(yīng)參照SYBR GreenRPro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒操作說明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線的繪制，評(píng)價(jià)反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。目標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)采用2-ΔΔCT法計(jì)算，內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。目的基因引物序列見表3。

表3 目的基因引物序列Table 3 Primers of target genes

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，2組數(shù)據(jù)間進(jìn)行單因素方差分析（獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)），檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGF小鼠模型評(píng)價(jià)

2.1.1 涂板培養(yǎng)驗(yàn)證

PGF小鼠糞便懸液平板涂板見圖1。

圖1 PGF小鼠糞便懸液平板涂板Fig.1 Pseudo-germfree mice’s fecal suspension coated plate

小鼠口服抗生素飲用水后，GAM培養(yǎng)基平板及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上菌落數(shù)目隨給藥時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，造模第11天時(shí)，基本達(dá)到無菌落狀態(tài)，證明小鼠糞便中厭氧菌及需氧菌在造模后含量下降，達(dá)到偽無菌狀態(tài)，造模成功。

2.1.2 ERIC-PCR驗(yàn)證

PGF小鼠糞便懸液腸道菌總DNA ERIC-PCR指紋圖譜見圖2。

圖2 PGF小鼠糞便懸液腸道菌總DNA ERIC-PCR指紋圖譜Fig.2 ERIC-PCR fingerprinting of intestinal bacteria obtained from pseudo-germfree mice

如圖2所示，通過天能凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件標(biāo)記條帶，隨抗生素給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，糞便細(xì)菌DNA的ERIC-PCR條帶亮度變暗，條帶數(shù)目減少，證明隨造模時(shí)間變化，小鼠糞便細(xì)菌豐度及數(shù)目減少?？股亟o藥第11天，ERIC-PCR條帶數(shù)目減少至1條且條帶亮度較暗，證明小鼠已達(dá)到偽無菌狀態(tài)，造模成功。

2.2 產(chǎn)芽孢菌液菌屬PCR驗(yàn)證

根據(jù)文獻(xiàn)[14]產(chǎn)芽孢菌菌液16S rRNA測(cè)序結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇其中最為常見的4個(gè)產(chǎn)芽孢菌菌屬：Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea，對(duì)提取得到的產(chǎn)芽孢菌菌液DNA進(jìn)行PCR鑒定，并選擇腸道菌群中常見的非產(chǎn)芽孢菌菌屬Lactobacillus和Bacteroides作為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖3所示。

圖3 產(chǎn)芽孢菌液菌屬PCR驗(yàn)證Fig.3 PCR verification of spore-forming microbes

由圖3可知，電泳可見有不同長(zhǎng)度的特異條帶，與糞便菌懸液PCR電泳條帶相比，產(chǎn)芽孢菌菌液仍保留有屬產(chǎn)芽孢菌的 Clostridium、Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group和Dorea的菌屬條帶，而并未擴(kuò)增出非產(chǎn)芽孢菌Lactobacillus和Bacteroides條帶。電泳結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的16S rRNA測(cè)序結(jié)果相一致，表明此方法成功提取出了糞便菌懸液中的產(chǎn)芽孢菌。

2.3 qPCR驗(yàn)證產(chǎn)芽孢菌定殖情況

用 Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 和Dorea的特異性引物，以各組小鼠糞便細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增有單峰的熔解曲線及特異熒光曲線生成，并給出了定量結(jié)果，見圖4。

圖4 qPCR驗(yàn)證產(chǎn)芽孢菌定殖情況Fig.4 Real-time quantitative PCR analysis of colonization of spore-forming microbes

由圖4可知，PGF+Sp.組小鼠體內(nèi)屬產(chǎn)芽孢菌的Ruminococcus、Ruminococcus_torques_group 及 Dorea顯著富集，相對(duì)含量顯著上升，證明小鼠體內(nèi)產(chǎn)芽孢菌定殖成功。

2.4 產(chǎn)芽孢菌對(duì)小鼠胃腸動(dòng)力的影響

2.4.1 小腸推進(jìn)率測(cè)定

產(chǎn)芽孢菌對(duì)小鼠胃腸動(dòng)力的影響見圖5。

圖5 小腸推進(jìn)率測(cè)定Fig.5 Determination of intestinal thrust rate

由圖5可知，將產(chǎn)芽孢菌定殖體內(nèi)后，小鼠小腸中的苯酚紅溶液推進(jìn)距離更遠(yuǎn)，小腸推進(jìn)率顯著提高，與PGF小鼠相比差異顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，產(chǎn)芽孢菌的定殖可以有效推進(jìn)小腸運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)功能。

2.4.2 胃殘留率測(cè)定

小鼠胃殘留率測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 胃殘留率測(cè)定Fig.6 Determination of gastric residual rate

由圖6可知，與PGF小鼠相比，產(chǎn)芽孢菌定殖后小鼠胃組織中殘留的苯酚紅溶液較少，胃殘留率下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，產(chǎn)芽孢菌可以增強(qiáng)胃動(dòng)力，減少胃殘留率。

2.5 產(chǎn)芽孢菌對(duì)5-HT含量的影響

結(jié)腸及血漿中5-HT濃度及5-HT/TRP比值見圖7。

圖7 產(chǎn)芽孢菌對(duì)5-HT含量的影響Fig.7 Effect of spore-forming microbes on 5-HT

5-HT作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，不僅分布于大腦中可以調(diào)節(jié)大腦皮層活動(dòng)，還可以在腸道內(nèi)合成以增強(qiáng)胃腸道蠕動(dòng)功能[19]，近年來在功能性胃腸疾病中廣受關(guān)注，并且有相關(guān)研究表明部分腸道微生物可以有效調(diào)節(jié)或參與到體內(nèi)5-HT代謝通路[20]。如圖7所示，與PGF小鼠相比，產(chǎn)芽孢菌的定殖可以提高結(jié)腸及血漿中5-HT含量以及5-HT/TRP比值，其中在結(jié)腸中的變化差異更為顯著。結(jié)果表明產(chǎn)芽孢菌可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)結(jié)腸及血漿中5-HT的含量，這與胃腸道蠕動(dòng)功能的增強(qiáng)有密切聯(lián)系。

2.6 產(chǎn)芽孢菌對(duì)小鼠結(jié)腸中TPH1酶mRNA表達(dá)水平的影響

各組小鼠結(jié)腸組織中TPH1酶mRNA表達(dá)情況見圖8。

圖8 產(chǎn)芽孢菌對(duì)小鼠結(jié)腸中TPH1酶mRNA表達(dá)水平的影響Fig.8 Effects of spore-forming microbes on TPH1 mRNA expression in colon

TPH1是機(jī)體外周系統(tǒng)合成5-HT的關(guān)鍵限速酶，可以介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)色氨酸分解成為5-羥色氨酸，進(jìn)而脫羧生成5-HT，通過此途徑產(chǎn)生的5-HT占體內(nèi)總量的90%以上。因此，TPH1的表達(dá)與5-HT含量有密切聯(lián)系[21]。由圖8可知，通過RT-qPCR測(cè)定結(jié)腸中TPH1酶mRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明與PGF組相比，產(chǎn)芽孢菌定殖導(dǎo)致TPH1酶mRNA表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.001）。這種下調(diào)可能是機(jī)體在暴露于微生物負(fù)擔(dān)后對(duì)5-HT過度釋放的適應(yīng)性反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)腸道5-HT系統(tǒng)的超敏性[22]。在胃腸蠕動(dòng)亢進(jìn)的腹瀉型腸易激綜合征患者腸道中5-HT含量升高、TPH1表達(dá)下降[23]，將正常小鼠的糞便定殖至無菌小鼠體內(nèi)可以有效提高腸道內(nèi)5-HT含量，并降低TPH1表達(dá)[22]。同時(shí)在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有些產(chǎn)芽孢菌（如Bacillus cereus）可以直接代謝生成5-HT[24]。因此推測(cè)產(chǎn)芽孢菌可通過代謝生成5-HT，使血漿、結(jié)腸中5-HT含量上升，負(fù)反饋調(diào)節(jié)TPH1表達(dá)下調(diào)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過抗生素雞尾酒法建立偽無菌小鼠模型，并采用氯仿提取法體外提取產(chǎn)芽孢菌菌液，通過口服灌胃的方式在偽無菌小鼠體內(nèi)定殖產(chǎn)芽孢菌，檢測(cè)小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)功能及5-HT的含量變化情況。結(jié)果表明，產(chǎn)芽孢菌定殖后小鼠的小腸推進(jìn)率、胃殘留率有明顯差異，胃腸蠕動(dòng)能力增強(qiáng)。此外，產(chǎn)芽孢菌還可以提高小鼠結(jié)腸及血漿中5-HT的含量，其中結(jié)腸的變化情況更為顯著。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出以下結(jié)論：產(chǎn)芽孢菌的定殖可通過提高腸道和血漿中5-HT含量水平以促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)。胃腸蠕動(dòng)過慢會(huì)導(dǎo)致消化液分泌減少，出現(xiàn)食欲下降、腹脹、惡心、便秘等消化不良的癥狀，而產(chǎn)芽孢菌的定殖可以有效增強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)功能，這為功能性消化不良、便秘型腸易激綜合征等疾病的治療提供了一個(gè)新思路，可以通過選擇性增加有益于胃腸運(yùn)動(dòng)的產(chǎn)芽孢菌以促進(jìn)相關(guān)疾病的治療。然而，為了能在腸道菌群干預(yù)措施中獲得最佳效益，還需要進(jìn)一步闡明產(chǎn)芽孢菌的定殖對(duì)機(jī)體是否會(huì)產(chǎn)生其他未知的影響以及產(chǎn)芽孢菌中具體菌種的調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究?jī)?nèi)容有待后期實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步探討。