蒼耳子化學(xué)成分及其對(duì)腺樣體的影響

張靈敏，李靜波，蔡紀(jì)堂，鄭琳靖

(河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

蒼耳子為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的成熟帶總苞的果實(shí)[1]。主要分布于河南、河北、內(nèi)蒙古、遼寧等地。蒼耳子性溫，味甘苦辛，有毒，具有發(fā)散風(fēng)寒、宣通鼻竅、祛風(fēng)止痛的功效，用于鼻淵、濕痹拘攣、風(fēng)疹瘙癢等。蒼耳子主要成分包括蒽醌、黃酮類、酚酸類、萜類、木脂素類、噻嗪類、甾體類[2]?，F(xiàn)代藥理作用顯示[3]，蒼耳子具有抗炎、抗病原微生物、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、清除自由基、提高機(jī)體免疫力等作用。本研究對(duì)蒼耳子90%乙醇提取物進(jìn)行分離、純化，得到12個(gè)化合物，所用化合物均為首次從蒼耳子中分離得到，化合物5、9可抑制腺樣體細(xì)胞的增殖。

1 材料

Bruker AVANCE NEO型核磁共振波譜儀、AVANCE NEO型質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker 公司)；Polartronic touch旋光儀(德國(guó)Schmidt haensch公司)；PLT1300型超聲波清洗器(濟(jì)南好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司)；MLKHYF1500S型全自動(dòng)離心機(jī)(浙江納德科學(xué)儀器有限公司)；UV-254型暗箱式紫外分析儀(德國(guó)Sigma公司)；YPF-267L型分析天平(美國(guó)Thermo 公司)；100～200、300～400目硅膠(青島海洋化工廠)；SephadeX LH-20凝膠(德國(guó)Eppendorf公司)；PLT96型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(菏澤嘉贏化工設(shè)備有限公司)。膠原酶(上海復(fù)申生物科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO，上海百運(yùn)渡生物科技有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT，湖北健楚生物醫(yī)藥有限公司)；苯環(huán)喹溴銨(四川維克奇生物科技有限公司)。所用試劑均為分析純。

蒼耳子采自河南省鄭州市，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院李靜波教授鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的成熟帶總苞的果實(shí)。

2 提取與分離

取蒼耳子21.6 kg，粉粹后，加入8倍體積的90%乙醇溶液浸泡6 d，然后加熱回流提取3次，每次2 h。收集提取液，經(jīng)減壓濃縮得蒼耳子浸膏2.4 kg。將浸膏超聲分散于蒸餾水，采用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，回收溶劑，得石油醚萃取浸膏(Fr.A)157.2 g、二氯甲烷萃取浸膏 (Fr.B) 171.3 g、丙酮萃取浸膏 (Fr.C) 205.4 g、正丁醇萃取浸膏(Fr.D)227.3 g。取Fr.B，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-丙酮 (80∶20∶0～50∶50∶0～0∶90∶10)梯度洗脫，得到8個(gè)組分(Fr.B1～Fr.B8)。取Fr.B3 (6.5 g)，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (50∶50∶0～10∶90∶0～0∶80∶20) 梯度洗脫，得到6個(gè)流分Fr.B3-1～Fr.B3-6。Fr.B3-4 (715 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮 (30∶70) 洗脫，得化合物5(23 mg)、9(19 mg)；Fr.B3-5 (627 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮 (50∶50) 洗脫，得化合物3(27 mg)。取Fr.B5 (7.1 g)，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯 (40∶60∶0～10∶90∶0～0∶90∶10) 梯度洗脫，得到7個(gè)流分Fr.B5-1～Fr.B5-7。Fr.B5-2 (648 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮 (20∶80) 洗脫，得化合物1(18 mg)；Fr.B5-6 (482 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮 (40∶60) 洗脫，得化合物7(18 mg)；Fr.B5-7 (513 mg) 經(jīng)Sephadex LH-20柱，以氯仿-甲醇 (30∶70) 進(jìn)行洗脫，得化合物2(19 mg)。取Fr.C，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯(70∶30∶0～50∶50∶0～0∶30∶70) 梯度洗脫，得到7個(gè)組分 (Fr.C1～Fr.7)。取Fr.C2 (5.7 g)，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-丙酮(40∶60∶0～10∶90∶0～0∶60∶40) 梯度洗脫，得到8個(gè)流分Fr.C2-1～Fr.C2-8。Fr.C2-2 (648 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-乙酸乙酯 (20∶80) 洗脫，得化合物4(28 mg)；Fr.C2-Fr.6 (764 mg) 經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶，得化合物12(21 mg)。取Fr.C4 (6.4 g)，采用硅膠柱層析分離，以石油醚-二氯甲烷-丙酮 (30∶70∶0～10∶90∶0～0∶40∶60) 梯度洗脫，得到9個(gè)流分Fr.C4-1～Fr.C4-9。Fr.C4-3 (516 mg) 經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮 (20∶80) 洗脫，得化合物6(21 mg)；Fr.C4-7 (764 mg)，經(jīng)Sephadex LH-20柱，以氯仿-甲醇 (30∶70) 進(jìn)行洗脫，得化合物8(31 mg)。取Fr.D，采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇 (90∶10∶0～50∶50∶0～0∶20∶80) 梯度洗脫，得到6個(gè)組分 (Fr.D1～6)。取Fr.D4 (9.1 g)，采用硅膠柱層析分離，以二氯甲烷-丙酮-甲醇 (30∶70∶0～10∶80∶10～0∶30∶70) 梯度洗脫，得到5個(gè)流分Fr.D4-1～Fr.D4-5。取Fr.D4-2 (682 mg)，經(jīng)Sephadex LH-20柱，以氯仿-甲醇 (30∶70) 進(jìn)行洗脫，得化合物10(31 mg)、11(24 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物2：白色粉末 (甲醇)，ESI-MSm/z:399.7[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.31 (1H，s，H-14)，4.03 (1H，t，J=9.6 Hz，H-15)，3.91 (1H，t，J=9.6 Hz，H-16a)，3.78 (1H，m，H-2)，3.65 (1H，t，J=9.6 Hz，H-16b)，3.57 (1H，d，J=9.6 Hz，H-19a)，3.22 (1H，d，J=9.6 Hz，H-19b)，1.42 (3H，s，H-22)，1.30 (3H，s，H-23)，0.97 (3H，s，H-18)，0.73 (3H，s，H-17)，0.69 (3H，s，H-20);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:49.2 (C-1)，64.1 (C-2)，43.7 (C-3)，40.2 (C-4)，54.6 (C-5)，23.1 (C-6)，37.2 (C-7)，139.2 (C-8)，49.6 (C-9)，40.8 (C-10)，22.4 (C-11)，34.2 (C-12)，36.1 (C-13)，128.3 (C-14)，80.2 (C-15)，64.1 (C-16)，25.3 (C-17)，26.4 (C-18)，65.1 (C-19)，18.6 (C-20)，109.4 (C-21)，27.3 (C-22)，26.2 (C-23)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為isopropylidenkirenol。

化合物4：白色粉末 (甲醇)，ESI-MSm/z:200.8[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:4.81 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1′)，4.31 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-5′)，4.03 (1H，dq，J=9.6，6.3 Hz，H-2)，3.91 (1H，dq，J=9.6，6.3 Hz，H-1)，3.76 (1H，brd，J=9.6 Hz，H-3)，1.35 (3H，t，J=9.6 Hz，H-4′);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:65.3 (C-1)，72.1 (C-2)，105.3 (C-1′)，75.2 (C-2′)，80.4 (C-3′)，71.4 (C-4′)，67.2 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為ethyl β-D-xylopyranoside。

化合物5：白色粉末(三氯甲烷)，ESI-MSm/z:310.2[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.68 (1H，d，J=9.6 Hz，H-4)，7.08 (1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，6.72 (1H，d，J=9.6 Hz，H-6)，6.22 (1H，d，J=9.6 Hz，H-3)，5.13 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-2′)，3.37 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-3′)，3.19 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-3′)，1.97 (3H，s，H-4″)，1.58 (3H，s，1″-CH3)，1.39 (3H，s，1″-CH3);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:130.2 (C-1)，156.1 (C-2)，115.8 (C-3)，148.2 (C-4)，126.2 (C-5)，106.8 (C-6)，166.2 (C-7)，113.5 (C-8)，150.1 (C-9)，115.2 (C-10)，106.8 (C-1′)，90.2 (C-2′)，30.1 (C-3′)，84.1 (C-1″)，169.2 (C-3″)，26.2 (C-4″)，27.1 (H3C-1″)，20.8 (H3C-4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一，故鑒定為columbianetin acetate。

化合物6：白色粉末 (甲醇)，ESI-MSm/z:552.7[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.58 (2H，d，J=9.6 Hz，H-7′，7″)，6.95 (2H，m，H-2，2′)，6.72 (2H，m，H-6′，6″)，6.48 (2H，m，H-5′，5″)，6.07 (2H，d，J=9.6 Hz，H-8′，8″)，5.64 (1H，m，H-5)，5.02 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-4)，4.37 (1H，m，H-3)，3.65 (3H，s，-OCH3-10);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:75.2 (C-1)，36.8 (C-2)，66.1 (C-3)，70.6 (C-4)，70.4 (C-5)，39.8 (C-6)，176.9 (C-7)，101.4 (C-8)，170.3 (C-9)，127.5 (C-1′)，114.2 (C-2′)，46.3 (C-3′)，152.4 (C-4′)，18.1 (C-5′)，123.1 (C-6′)，147.2 (C-7′)，115.3 (C-8′)，129.6 (C-1″)，115.4 (C-2″)，46.9 (C-3″)，149.2 (C-4″)，118.1 (C-5″)，123.0 (C-6″)，149.3 (C-7″)，115.2 (C-8″)，170.4 (C-9″)，55.2 (H3CO-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為4，5-二咖啡?；鼘幩峒柞?。

化合物7：白色粉末 (三氯甲烷)，285.2[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:11.07 (1H，s，8-OH)，6.51 (1H，d，J=9.6 Hz，H-7)，6.37 (1H，d，J=9.6 Hz，H-5)，6.09 (1H，s，H-4)，4.02 (3H，s，H3CO-9)，2.61 (2H，t，J=9.6 Hz，H-1′)，1.81 (2H，m，H-2′)，1.37 (2H，m，H-3′)，1.28 (2H，m，H-4′)，0.91 (3H，t，J=9.6 Hz，H-5′);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:166.8 (C-1)，153.1 (C-2)，161.2 (C-3)，104.2 (C-4)，100.3 (C-5)，166.1 (C-6)，102.4 (C-7)，165.1 (C-8)，34.2 (C-1′)，28.1 (C-2′)，30.4 (C-3′)，23.4 (C-4′)，15.1 (C-5′)，138.2 (C-4a)，100.2 (C-8a)，57.3 (H3CO-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為8-hydroxy-6-methoxy-3-pentylisocoumarin。

化合物8:白色粉末 (丙酮)，ESI-MSm/z:441.2[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.72 (4H，s，H-2′，6′，2″，6)，5.52 (2H，s，OH)，4.91 (2H，d，J=9.6 Hz，H-2，6)，3.91 (12 H，s，H3CO-4)，3.81 (2H，m，H-4a，8a)，3.62 (2H，m，H-4b，8b)，3.12 (2H，m，H-1，5);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:54.2 (C-1)，86.1 (C-2)，74.6 (C-3)，70.8 (C-4)，54.2 (C-5)，86.1 (C-6)，64.2 (C-7)，70.8 (C-8)，132.4 (C-1′)，104.2 (C-2′)，147.2 (C-3′)，135.1 (C-4′)，147.2 (C-5′)，104.2 (C-6′)，132.4 (C-1″)，104.2 (C-2″)，147.2 (C-3″)，135.1 (C-4″)，147.2 (C-5″)，104.2 (C-6″)，57.2 (H3CO-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為diasyringaresinol。

化合物9:白色粉末 (三氯甲烷)，ESI-MSm/z:413.1[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.25 (1H，t，J=9.6 Hz，H-3)，5.58 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1)，5.42 (1H，m，H-8)，5.09 (1H，m，H-10a)，4.96 (1H，m，H-10β)，4.68 (1H，d，J=9.6 Hz，H-1′)，4.02 (1H，m，H-6′a)，3.68 (1H，m，H-6′β)，3.58 (2H，m，H-6)，3.41～3.02 (4H，m，H-2′，3′，4′，5′)，2.93 (1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H-5)，2.31 (1H，q，J=9.6 Hz，H-9);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:97.1 (C-1)，90.8 (C-2)，153.1 (C-3)，110.3 (C-4)，28.1 (C-5)，36.3 (C-6)，169.3 (C-7)，134.1 (C-8)，46.3 (C-9)，119.4 (C-10)，176.3 (C-11)，103.1 (C-1′)，74.1 (C- 2′)，78.2 (C-3′)，70.8 (C-4′)，77.3 (C-5′)，62.8 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14] 基本一致，故鑒定為secologanoside。

化合物10:白色粉末 (丙酮)，ESI-MSm/z:293.1[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:2.43 (2H，t，J=9.6 Hz，H-2)，1.69 (2H，m，H-3)，1.28 (26H，brs，H-4～16)，0.87 (3H，t，J=9.6 Hz，17-CH3);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:179.4 (C-1)，33.7 (C-2)，32.4 (C-3)，21.7～30.2 (13×CH2)，15.2 (H3C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為十七烷酸。

化合物11:白色粉末 (三氯甲烷)，ESI-MSm/z:321.2[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:2.41 (2H，t，H-2，3)，1.72 (2H，m，H2C-1)，1.31 (30H，m，H-4～13)，0.79 (3H，t，16-CH3);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:179.6 (C-1)，36.6 (C-2)，28.1 (C-3)，25.4～27.6 (12×CH2)，21.3 (C-18)，12.8 (C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為十九烷酸。

化合物12:白色粉末 (丙酮)，ESI-MSm/z:272.9[M+Na]+。1H-NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.52 (1H，d，J=9.6 Hz，H-13a)，5.61 (1H，d，J=9.6 Hz，H-13b)，4.23 (1H，m，H-8)，4.02 (1H，t，J=9.6 Hz，H-4)，0.92 (3H，d，J=9.6 Hz，H-14)，0.77 (3H，s，H-15);13C-NMR (150 MHz，CD3OD)δ:45.3 (C-1)，25.1 (C-2)，30.4 (C-3)，85.3 (C-4)，44.7 (C-5)，38.3 (C-6)，49.1 (C-7)，83.7 (C-8)，46.4 (C-9)，30.2 (C-10)，139.2 (C-11)，171.2 (C-12)，119.2 (C-13)，20.3 (C-14)，26.3 (C-15)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為2-desoxy-4-epi-pulchellin。

4 化合物對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞的影響

收集2021年5～6月在河南省中醫(yī)院就診的腺樣體肥大患兒20例，行腺樣體肥大切除術(shù)取腺樣體。腺樣體經(jīng)0.9%氯化鈉沖洗，進(jìn)行組織粉粹，經(jīng)膠原酶溶解后，于37.0 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2 h，10 ℃下離心(2 000 r/min，10 min)，吸除上清液。加入含DMEM培養(yǎng)皿，于37.0 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 h，取懸浮細(xì)胞移至96 孔板中，于37.0 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后加入生長(zhǎng)因子繼續(xù)培養(yǎng)12 d，取腺樣體肥大細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組(含60 mg/L LPS+0.1、1、5、10、50 mg/L化合物)；空白組(含60 mg/L LPS+生理鹽水)；陽(yáng)性組(含60 mg/L LPS +2 mg/mL苯環(huán)喹溴銨)。參考文獻(xiàn)[18]，采用 MTT 法檢測(cè)化合物2、5、8～9對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞的影響。將腺樣體肥大細(xì)胞移至96孔板中，于37.0 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，依次加入60 mg/L LPS+0.1、1、5、10、50 mg/L化合物；60 mg/L LPS+生理鹽水；60 mg/L LPS +2 mg/mL苯環(huán)喹溴銨。培養(yǎng)24 h，加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄去上層培養(yǎng)液，每孔分別加入90 μL DMSO，輕輕振蕩后，于520 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度，計(jì)算對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞的抑制率及IC50值。見表1。

表1 各化合物對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞的抑制作用(%)Tab.1 Inhibitory effects of compounds on adenoid mast cells(%)

5 討論

蒼耳子為臨床常用的藥物，本實(shí)驗(yàn)從蒼耳子中分離得到11個(gè)化合物，均為首次從該植物中分離得到，其中化合物2、3、5、9、11為首次從該屬植物中分離得到。研究化合物2、5、8～9對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示化合物5、9對(duì)腺樣體肥大細(xì)胞增殖具有抑制作用。以期本研究豐富了蒼耳子化學(xué)成分的資料庫(kù)，為耳鼻喉科的新藥研發(fā)提供參考。