基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的作用機(jī)制

朱麗云，鐘 鈺，柳小莉，鄭 琴*，李文靜，任桂林，肖 帥

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

失眠，又稱為“不寐癥”，是指患者對睡眠時間和(或)質(zhì)量不滿足并影響其日間社會功能的一種主觀體驗(yàn)[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國目前有3億的失眠患者，這個數(shù)字正逐年增加并趨于年輕化。長期的慢性失眠會導(dǎo)致肥胖[2]、糖尿病、高血壓[3-4]、心腦血管[5]等疾病，還會導(dǎo)致焦慮癥、抑郁癥等精神疾病[6]。目前臨床治療失眠常見的藥物有苯二氮卓類和非苯二氮卓類受體激動劑、褪黑素受體激動劑、食欲素受體拮抗劑、抗組胺受體藥以及鎮(zhèn)靜類抗抑郁藥[7-8]，長期使用會產(chǎn)生依賴性、宿醉、嗜睡、體質(zhì)量增加以及第2天眩暈等副作用[9]。盡管失眠現(xiàn)象普遍存在，但發(fā)病機(jī)制仍未有清晰的定義，因此，尋找新療法、新方法仍是當(dāng)下研究的主要方向。

當(dāng)歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，又名云歸、西歸、秦歸，為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，性溫、辛、甘，入肝、心、脾經(jīng)，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便的功能[10]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯通過緩解氯胺酮興奮中樞的作用，緩解實(shí)驗(yàn)動物的躁動不安，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)靜作用[11]。通過腹腔注射藁本內(nèi)酯，可顯著降低戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠潛伏期，延長睡眠持續(xù)時間[12]。然而當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的機(jī)制尚未明確，本研究主要是通過GC-MS分析當(dāng)歸揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)，為當(dāng)歸揮發(fā)油防治失眠的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 當(dāng)歸(產(chǎn)地甘肅岷縣，批號20201210)經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉榮華教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，質(zhì)量符合2020年版《中國藥典》第一部的要求。

1.2 試劑與儀器 無水乙醇(批號2011039)、無水硫酸鈉(批號2009032)購自西隴科學(xué)股份有限公司，均為分析純。DZTW控溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；HLD-30002型電子天平(杭州友恒稱重設(shè)備有限公司)；Agilent 7 890 A/5975C型GC-MS儀器(美國安捷倫公司)。

2 方法

2.1 當(dāng)歸揮發(fā)油提取 參考文獻(xiàn)[13]方法，精密稱取當(dāng)歸中藥材粗粉100.00 g，裝入2 L圓底燒瓶中，加入1 000 mL水，浸泡2 h，提取8 h，收集提取器中的當(dāng)歸揮發(fā)油，加入適量的無水硫酸鈉，靜置、脫水，即得當(dāng)歸揮發(fā)油。

2.2 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS分析 氣相色譜條件[14]，HP-5MS毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230 ℃采用程序升溫(80 ℃以3 ℃/min升溫至167 ℃，保持2.5 min；以2 ℃/min升至202 ℃；以4 ℃/min升至280 ℃，保持15 min)；載氣為高純氦氣；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。質(zhì)譜條件，離子源溫度230 ℃；電子轟擊電離源，電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描范圍35～550m/z。

2.3 當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分鑒定 數(shù)據(jù)處理采用Data Analysis軟件完成。將其閾值調(diào)整為16，對當(dāng)歸揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行篩選。所分辨的質(zhì)譜在NIST 17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫中檢索，根據(jù)匹配度、保留指數(shù)和文獻(xiàn)已報道物質(zhì)進(jìn)行核對，確定當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分。

2.4 當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫篩選當(dāng)歸揮發(fā)油主要活性成分作用靶點(diǎn)。所獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)中，靶點(diǎn)名稱限定物種為人，規(guī)范靶點(diǎn)名稱，獲得UniProt號。

2.5 失眠潛在作用靶點(diǎn)的篩選 通過Therapeutic Target Datebase數(shù)據(jù)庫(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)以“insomnia”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索失眠相關(guān)靶點(diǎn)。刪除重復(fù)靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫校正為官方名稱。

2.6 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-失眠靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線數(shù)據(jù)庫將獲得的當(dāng)歸揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與失眠疾病靶點(diǎn)取交集，將交集靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn)，潛在靶點(diǎn)對應(yīng)的化學(xué)成分視為潛在活性成分。將當(dāng)歸揮發(fā)油的活性成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建當(dāng)歸揮發(fā)油活性成分作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的主要靶點(diǎn)和活性成分。

2.7 蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[15]中，設(shè)置Organism為人類“Homosapiens”，以置信度(combined score)≥0.40為篩選標(biāo)準(zhǔn)，PPI結(jié)果以tsv格式下載，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，運(yùn)用Network Analyzer插件對靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算分析，以拓?fù)鋮?shù)度值(degree)大于各節(jié)點(diǎn)度值平均數(shù)的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

2.8 信號通路與生物過程分析 將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫[16-17](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)，Select Identifier選擇“official gene symbol”，List Type設(shè)置為“gene list”，物種選擇為“Homosapiens”，設(shè)定閾值P<0.01。對當(dāng)歸揮發(fā)油防治失眠的靶點(diǎn)進(jìn)行g(shù)eneontology選項(xiàng)下(GO，功能富集分析)生物過程(biology process)和Pathways選項(xiàng)下(KEGG，基因組百科全書)信號通路富集分析，獲得當(dāng)歸揮發(fā)油與疾病之間的生物過程和信號通路富集分析。利用在線繪圖平臺ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將其結(jié)果進(jìn)行可視化。

2.9 靶點(diǎn)-組織分布網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫[18]，查找潛在靶點(diǎn)組織分布，下載tsv的格式文件，對數(shù)據(jù)表達(dá)量(NX)大于10的的組織或器官(tissue)進(jìn)行分析，應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-組織網(wǎng)絡(luò)。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果 通過GC-MS分析鑒定出了14個化學(xué)成分，如圖1所示，相對含量為當(dāng)歸揮發(fā)油的99.57%，其中最高的是Ligustilide(81.70%)、trans-beta-Ocimene(7.96%)，見表1。

圖1 當(dāng)歸揮發(fā)油GC-MS總離子流圖

3.2 潛在靶點(diǎn)的篩選 采用TCMSP、Pubchem、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫獲得的成分靶點(diǎn)，TTD、DrugBank、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫獲得的疾病靶點(diǎn)，分別剔除重復(fù)靶點(diǎn)，得到144個成分靶點(diǎn)和172個疾病靶點(diǎn)，兩者取交集得到41個交集靶點(diǎn)，作為潛在靶點(diǎn)。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 如圖2所示，包含了38個節(jié)點(diǎn)，161條邊。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1中Network Analyzer插件對靶點(diǎn)進(jìn)行運(yùn)算分析，degree平均值為8.47，degree值表示靶點(diǎn)之間的相互作用，其值越大，節(jié)點(diǎn)也越大，表明當(dāng)歸揮發(fā)油可能通過作用于這些關(guān)鍵靶點(diǎn)得以在失眠癥中發(fā)揮作用。根據(jù)靶點(diǎn)運(yùn)算分析結(jié)果，SLC6A4的degree值最大，其次是CHRNA4、DRD2、HTR2A等，見表2。

3.4 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 如圖3所示，有54個節(jié)點(diǎn)，其中化合物節(jié)點(diǎn)12個，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)41個，126條邊，每條邊代表當(dāng)歸揮發(fā)油成分-疾病靶點(diǎn)之間的相互作用，用degree值表示，節(jié)點(diǎn)大小代表degree值大小(紅色三角形節(jié)點(diǎn)代表當(dāng)歸，綠色V形節(jié)點(diǎn)代表化學(xué)成分，藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn))，degree值越大與節(jié)點(diǎn)連接的靶點(diǎn)越多。在網(wǎng)絡(luò)中，有16個節(jié)點(diǎn)的degree值≥ 4.67(平均值)，有效成分節(jié)點(diǎn)有9個，見表3。

表1 當(dāng)歸揮發(fā)油主要化學(xué)成分

圖2 核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 當(dāng)歸揮發(fā)油成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

表3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)成分信息

3.5 GO生物過程分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物富集分析得到104個條目，以條形圖展示排名前20的通路，其中包含63個生物過程(BP)條目，25個分子功能(MF)條目和16個細(xì)胞組成(CC)條目，見圖4。生物過程主要涉及G-蛋白偶聯(lián)受體信號通路(G-protein coupled receptor signaling pathway)、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(chloride transmembrane transport)、γ-氨基丁酸信號通路(gamma-aminobutyric acid signaling pathway)、腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路(adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)、細(xì)胞增殖(cell proliferation)等；分子功能主要涉及質(zhì)膜(plasma membrane)、突觸后膜(postsynaptic membrane)、神經(jīng)元細(xì)胞體(neuronal cell body)、GABA-A 受體復(fù)合物(GABA-A receptor complex)、氯離子通道復(fù)合體(chloride channel complex)等；細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性(extracellular ligand-gated ion channel activity)、GABA-A受體活性(GABA-A receptor activity)、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性(G-protein coupled acetylcholine receptor activity)、腎上腺素結(jié)合(epinephrine binding)、苯二氮卓受體活性(benzodiazepine receptor activity)等。

3.6 KEGG信號通路分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號通路分析得到18條信號通路(P<0.01)，如圖5所示，主要涉及神經(jīng)活動配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣離子信號通路(Calcium signaling pathway)、γ-氨基丁酸能突觸(GABAergic synapse)、膽堿能突觸(Cholinergic synapse)、cGMP-PKG信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)等。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集通路

3.7 組織-靶點(diǎn)分布圖 通過整理分析，共獲得2 483條組織數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)表達(dá)量NX大于10的組織進(jìn)行分析，篩選出280條組織(tissue)數(shù)據(jù)，見圖6(綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)，紅色菱形節(jié)點(diǎn)代表組織或器官靶點(diǎn)，度值越大，節(jié)點(diǎn)越大)。結(jié)果表明41個潛在靶點(diǎn)分別在基底神經(jīng)節(jié)、大腦皮層、嗅覺、腦橋和髓質(zhì)、海馬等組織中表達(dá)。

圖6 組織-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

4 結(jié)論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，通過多學(xué)科的交叉應(yīng)用和整體生物網(wǎng)絡(luò)的整合與分析，構(gòu)建藥物與疾病作用靶點(diǎn)間的相互作用，闡述中藥活性成分間的協(xié)同作用，通過“中藥-成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探討藥物與疾病間的相互作用，為藥物開發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)[19]。

研究表明，當(dāng)歸揮發(fā)油主要是由苯酞類化合物、苯酚類二聚體、萜類、酚類及烷烴化合物為主，其藁本內(nèi)酯(Ligustilide)含量最高,其次是丁烯基酞內(nèi)酯[3-Butylisobenzofuran-1(3H)-one][20]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[21]，當(dāng)歸揮發(fā)油對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，通過腹腔注射藁本內(nèi)酯98、196 mg/kg，均能抑制小鼠的自發(fā)活動，延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的睡眠持續(xù)時間，降低體溫，抑制電刺激誘發(fā)的激怒反應(yīng)(P<0.01)。王宇等[22]研究發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯能結(jié)合和激動GABAA受體的苯二氮卓類位點(diǎn)，達(dá)到鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗癲癇的作用。丁烯基酞內(nèi)酯是當(dāng)歸揮發(fā)油中苯酞類活性成分，研究發(fā)現(xiàn)其不僅是有效的5-HT和去甲腎上腺素再攝取的抑制劑，而且對單氨氧化酶具有一定的抑制作用[23]。Deng等[24]發(fā)現(xiàn)苯酞類二聚體化合物Riligustilide、Gelispirolide與GABA受體具有較號的結(jié)合能力，這表明苯酞類化合物具有防治失眠的潛力。

通過GC-MS結(jié)果分析顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油主要包含Ligustilide、trans-beta-Ocimene、Z-Butylidenephthalide等14種活性成分，對當(dāng)歸揮發(fā)油進(jìn)行檢索和篩選，獲得14種成分對應(yīng)144個靶點(diǎn)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析表明，當(dāng)歸揮發(fā)油中SLC6A4、CHRNA4、DRD2、HTR2A、CHRM1等靶點(diǎn)治療失眠的可能性較大。SLC6A4、HTR2A是色氨酸途徑中的關(guān)鍵調(diào)控基因，維持5-HT的穩(wěn)態(tài)[25]。CHRNA4是神經(jīng)元nAChR的主要基因，其突變可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[26]。DRD2廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，是最重要的多巴胺自身受體[27]。綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油中的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能是通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而防治失眠，間接證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是預(yù)測成分靶點(diǎn)的有力工具。

核心靶點(diǎn)與組織分布結(jié)果表明，41個潛在靶點(diǎn)在神經(jīng)遞質(zhì)中高表達(dá)。KEGG結(jié)果顯示，當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠潛在作用靶點(diǎn)主要涉及G-蛋白偶聯(lián)受體信號通路、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、γ-氨基丁酸信號通路等生物過程，主要涉及細(xì)胞外配體門控離子通道活性、GABA-A受體活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等分子功能，主要涉及質(zhì)膜、神經(jīng)元細(xì)胞體、GABAA受體復(fù)合物等細(xì)胞組成。主要與神經(jīng)活動配體-受體相互作用、鈣信號通路、γ-氨基丁酸能突觸、膽堿能突觸、cGMP-PKG信號通路、5-羥色胺能突觸等通路有關(guān)。當(dāng)歸揮發(fā)油的活性成分主要與以上生物過程、分子功能、細(xì)胞組成以及信號通路達(dá)到治療失眠癥的目的。

綜上所述，當(dāng)歸揮發(fā)油治療失眠的作用靶點(diǎn)，分布于不同的代謝通路，多成分、多靶點(diǎn)以及多通路的相互作用是治療失眠癥的特點(diǎn)。研究結(jié)果初步驗(yàn)證了當(dāng)歸揮發(fā)油的作用機(jī)制和基礎(chǔ)藥理學(xué)作用，為進(jìn)一步研究探討作用機(jī)制提供了理論依據(jù)及研究方向。