鳳仙透骨草抗真菌有效部位化學(xué)成分的研究

顧媛媛，陳 媚，王連芝，張洪財(cái)，鄒迪新

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

鳳仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.來源于鳳仙花科鳳仙花屬鳳仙花的干燥莖，為一年生草本植物，性寒、味甘，微苦，具祛風(fēng)除濕、活血、消腫止痛之功效[1]。千百年來，中醫(yī)廣泛用于治療甲溝炎、手足癬等細(xì)菌、真菌性疾病，歷代本草均有相關(guān)記載。為了探尋鳳仙透骨草抗真菌作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步開發(fā)利用該資源，本實(shí)驗(yàn)在以往的研究基礎(chǔ)上[2-3]，繼續(xù)對鳳仙透骨草抗真菌活性部位即乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行深入系統(tǒng)的化學(xué)成分分離，得到14個(gè)化合物，其中，化合物8～9、13首次從該植物中分離得到的。

1 材料

Bruker-400型超導(dǎo)核磁共振光譜儀(德國Bruker公司)；Waters 2695型分析型HPLC、Waters 2996 APD檢測器、LCT Premier XE TOF-MS飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國Waters公司)；ZF-8D型暗箱四用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；柱色譜硅膠(青島海洋化工廠，80～100、200～300目)；薄層色譜用硅膠(青島海洋化工廠)；C18分析型色譜柱(美國DIKMA公司；5 μm，250 mm×4.6 mm)；密度計(jì)(沈陽市衛(wèi)工玻璃計(jì)器廠)；RP-18反相板(德國Merck公司)；柱色譜用反相ODS(ODS-AM，日本YMC公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)。HPLC所用溶劑甲醇、乙腈(美國迪馬公司，色譜純)；提取分離試劑均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

鳳仙透骨草于2011年采自黑龍江省蘭西縣，經(jīng)黑龍江醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為鳳仙花屬植物鳳仙透骨草ImpatiensbalsaminaL.，憑證標(biāo)本(編號201107-10)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。

2 提取與分離

將干燥的鳳仙透骨草20.0 kg，剪成小塊，用95%乙醇溶液加熱回流提取3次，每次2 h，濾過，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，得乙醇提取物。將該乙醇提取物用水混懸后，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、水飽和的正丁醇梯度萃取多次，得到乙酸乙酯萃取物246.0 g。該部位經(jīng)硅膠柱分離，采用二氯甲烷-甲醇(100∶1～15∶1)梯度洗脫，得到6個(gè)不同極性段流分Fr.1～Fr.6。Fr.1經(jīng)硅膠柱，二氯甲烷-甲醇(100∶1)洗脫并重結(jié)晶分離得化合物8(11.3 mg)、9(13.1 mg)。Fr.2用二氯甲烷-甲醇(85∶1)洗脫，Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(30∶70)洗脫得化合物1(23.0 mg)、13(9.5 mg)。Fr.3經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇(70∶1)梯度洗脫，Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(40∶60)分離得化合物3(6.6 mg)、6(10.4 mg)、7(11.0 mg)。Fr.4經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇(40∶1～0∶1)梯度洗脫，得Fr.4a～Fr.4c 3個(gè)亞流分，F(xiàn)r.4a(40∶1)經(jīng)制備HPLC甲醇-水(45∶55)分離得化合物2(7.2 mg)，F(xiàn)r.4b(20∶1)經(jīng)Sephadex LH-20反相色譜甲醇-水(20∶80)分離得化合物4(6.2 mg)、5(13.0 mg)。Fr.4c(0∶1)經(jīng)反相中壓柱甲醇-水(35∶65)洗脫得化合物10(13.5 mg)。Fr.5經(jīng)硅膠柱二氯甲烷-甲醇(15∶1)洗脫，反相中壓柱甲醇-水(30∶70)梯度洗脫，經(jīng)制備HPLC甲醇-水(15∶85)洗脫分離得化合物14(14.3 mg)，再經(jīng)制備HPLC洗脫分離得化合物11(16.7 mg)、12(13.8 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp182～183 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δ:3.90(3H,s,-OCH3),6.17(1H,s,H-3),7.72(2H,m,H-6,7)，8.11(2H,m,H-5,8);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:180.0(C-1),160.4(C-2),109.8(C-3),184.8(C-4),126.4(C-5),134.5(C-6),133.3(C-7),123.5(C-8),131.0(C-9),131.9(C-10),56.4(C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[4]基本一致，故鑒定為2-甲氧基-1,4-萘醌。

化合物2：淡黃色粉狀結(jié)晶(甲醇)，mp172～173 ℃。ESI-MSm/z:219.1[M+Na]+，分子式C10H12O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.58(1H,d,J=15.8 Hz,H-2),6.32(1H,d,J=15.8 Hz,H-3),7.16(1H,d,J=1.9 Hz,H-5),7.05(1H,dd,J=1.9,8.2 Hz,H-9),6.80 (1H,d,J=8.2 Hz,H-8),3.88(3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:127.7(C-1),111.6(C-2),149.3(C-3),150.5(C-4),115.9(C-5),124.0(C-6),146.9(C-7),116.4(C-8),170.9(C-9),56.4(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]基本一致，故鑒定為阿魏酸。

化合物3：淡黃色結(jié)晶(甲醇)，mp204～205 ℃。ESI-MSm/z:211.0[M+Na]+，分子式C11H8O3。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.83(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.09 (1H,s,H-5),6.75 (1H,s,H-8),6.19(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.89 (3H,s,-OCH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:164.0(C-2),109.9(C-3),147.0(C-4),112.5(C-5),146.1(C-6),152.9(C-7),103.9(C-8),151.4(C-9),112.6(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為東莨菪素。

化合物4：淡黃色粉末(甲醇)，mp276～278 ℃。ESI-MSm/z:287.0[M+H]+，分子式C15H10O6。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.89(2H,d,J=10.4 Hz,H-3′,5′),8.07(2H,d,J=10.4 Hz,H-2′,6′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:148.0(C-2),137.1(C-3),177.3(C-4),158.2(C-5),99.2(C-6),16.6(C-7),94.4(C-8),162.5(C-9),104.5(C-10),123.7(C-1′),130.6(C-2′,6′),116.3(C-3′,5′),160.5(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為山柰酚。

化合物5：白色針狀晶體(甲醇)，mp210～212 ℃。ESI-MSm/z:191.0[M+Na]+，分子式C8H8O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:3.87(3H,s,3-OCH3),7.55(1H,dd,J=8.7,1.9 Hz,H-6),6.82(1H,d,J=8.7 Hz,H-5),7.53(1H,d,J=1.9 Hz,H-2);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.0(CO),152.6(C-4),148.6(C-3),125.2(C-6),123.0(C-5),115.8(C-2),113.7(C-1),56.3(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為香草酸。

化合物6：淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇)，mp272～274 ℃，ESI-MSm/z:179.0[M+H]+，分子式C9H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.16(1H,d,J=9.4 Hz,H-3),7.77(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.74(1H,s,H-8),6.92(1H,s,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:164.3(C-2),112.8(C-3),146.0(C-4),113.0(C-5),144.5(C-6),152.0(C-7),103.6(C-8),150.4(C-9),112.4(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為七葉內(nèi)酯。

化合物7：白色晶體狀粉末(甲醇)，mp194～198 ℃，ESI-MSm/z:177.0[M+Na]+，分子式C7H6O4。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.42(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),7.40(1H,dd,J=9.6,1.9 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=9.6 Hz,H-5);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:170.2(-COOH),151.5(C-4),146.0(C-3),123.9(C-1),123.1(C-6),117.7(C-2),115.7(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為原兒茶酸。

化合物8：白色粉末(甲醇)，mp792～794 ℃，ESI-MSm/z:383.4[M+H]+，分子式C25H50O2。1H-NMR(400 MHz,C5D5N)δ:0.86(3H,t,J=6.7 Hz,-CH3),1.25～1.41(44H,m,22×-CH2),1.79(2H,m),2.51(2H,t,J=7.4 Hz);13C-NMR(100 MHz,C5D5N)δ:176.0(-COOH),29.8(-CH2),14.3(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為二十五烷酸。

化合物9：白色片狀結(jié)晶(氯仿)，mp162～166 ℃，ESI-MSm/z:413.4[M+H]+，分子式C29H48O。1H-NMR(400 Hz,CDCl3)δ:5.15(2H,dd,J=8.6,12.8 Hz,H-22,23),5.02(1H,dd,J=8.6,15.1 Hz,H-7),3.59(1H,m,H-3),1.02(3H,d,J=6.6 Hz,21-CH3),0.84(3H,d,J=6.4 Hz,27-CH3),0.78～0.80(9H,3×-CH3),0.54(3H,s,18-CH3);13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δ:139.5(C-8),138.1(C-22),129.4(C-23),117.4 (C-7),71.0(C-3),55.8(C-17),55.1(C-14),51.2(C-24),49.4(C-9),43.2(C-13),40.8(C-20),40.1(C-5),39.4(C-12),37.9(C-4),37.1(C-1),34.2(C-10),31.8(C-25),31.4(C-2),29.6(C-6),28.5(C-16),25.3(C-28),23.0(C-15),21.5(C-11),21.3(C-21),21.0(C-27),18.9(C-26),13.0 (C-19),12.2 (C-29),12.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為α-菠甾醇。

化合物10：黃色針狀晶體(甲醇)，mp314～316 ℃，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性結(jié)果，Molish反應(yīng)陰性，ESI-MSm/z:303.0[M+H]+，分子式C15H10O7。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.17(1H,s,J=2.1 Hz,H-6),6.38(1H,s,J=2.1 Hz,H-8),6.87(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.62(1H,dd,J=8.5,2.2 Hz,H-6′)，7.72(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′);13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:177.3(C-4),165.5(C-7),162.5(C-5),158.2(C-9),148.7(C-4′),147.9(C-2),146.2(C-3′),137.2(C-3),124.1(C-1′),121.6(C-6′),116.2(C-5′),115.9(C-2′),104.5(C-10),99.2(C-6),94.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為槲皮素。

化合物11：黃色結(jié)晶(氯仿)，mp238～240 ℃，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性結(jié)果，Molish反應(yīng)陽性，ESI-MSm/z:465.0[M+H]+，分子式C21H20O12。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.20(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz,H-1″),6.86(1H,d,J=8.5 Hz,H-5′),7.58(1H,dd,J=2.2,8.5 Hz,H-6′),7.70(1H,d,J=2.2 Hz,H-2′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:159.0(C-2),135.6(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.8(C-6),166.0(C-7),94.6(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),123.1(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.0(C-5′),123.0(C-6′),104.2(C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.2(C-4″),78.1(C-5″),62.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物12：淡黃色粉末，鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽性，Molish反應(yīng)呈陽性，mp173～175 ℃，ESI-MSm/z:449.0[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.87(2H,d,J=8.9 Hz,H-3′,5′),8.04(2H,d,J=8.9 Hz,H-2′,H-6′),6.19(1H,d,J=2.1 Hz,H-6),6.39(1H,d,J=2.1 Hz,H-8),5.25(1H,d,J=7.5 Hz)為端基糖質(zhì)子信號；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)中給出了19個(gè)碳信號，δ:159.0(C-2),135.4(C-3),179.5(C-4),163.1(C-5),99.9(C-6),166.0(C-7),94.7(C-8),158.5(C-9),105.7(C-10),122.8(C-1′),117.5(C-2′),145.9(C-3′),149.8(C-4′),116.5(C-5′),122.0(C-6′),104.0 (C-1″),75.7(C-2″),78.4(C-3″),71.3(C-4″),78.0(C-5″),62.6(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物13：紅色油狀物，ESI-MSm/z:279.2[M+H]+，分子式C21H20O9。1H-NMR(400 MHz,CDC13)δ:0.97(d,J=6.8 Hz,6H,H-3″,H-4″),0.93(d,J=7.6 Hz,3H,H-4′),7.52(2H,m,J=3.3,5.8 Hz,H-3,H-4),7.71(2H,m,J=3.3,4.4 Hz,H-2,H-5)，4.30(2H,t,J=6.6 Hz,H-1′),4.08(2H,d,J=6.7 Hz,H-1″),2.00～2.06(1H,m,H-2″),1.67～1.74(2H,m,H-2′),1.38～1.46(2H,m,H-3′);13C-NMR(100 MHz,CDC13)δ:132.3(C-1),132.3(C-2),128.8(C-3),130.9(C-4),130.9(C-5),128.8(C-6),167.6(C-1a),167.6(C-2a),71.7(C-1′),27.7(C-2′),19.1(C-3′),19.1(C-4′),65.5(C-1″),29.7(C-2″),30.5(C-3″),13.7(C-4″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸正丁異丁酯。

化合物14：白色固體，溶于甲醇，mp196～198 ℃，Molish反應(yīng)陽性，異羥肟酸鐵反應(yīng)陽性，ESI-MSm/z:341.1[M+H]+，分子式C15H16O9。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:6.29(1H,d,J=9.2 Hz,H-3),7.82(1H,d,J=9.2 Hz,H-4),7.03(1H,s,H-8),7.20(1H,s,H-5),4.96(1H,d,J=7.5 Hz,H-1′),3.22～3.96歸屬于葡萄糖上的其他質(zhì)子信號；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：163.6(C-2),114.8(C-3),145.6(C-4),113.9(C-5),150.5(C-6),149.6(C-7),105.4(C-8),103.1(C-1′),74.7(C-2′),77.5(C-3′),71.3(C-4′),78.6(C-5′),62.4(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為七葉苷。

4 討論

迄今為止，鳳仙透骨草化學(xué)成分的研究多集中在花及其種子，其莖的化學(xué)成分研究則很少[18]。為了尋找其有效成分，進(jìn)一步開發(fā)利用該植物資源，本實(shí)驗(yàn)對鳳仙透骨草的抗真菌有效部位乙酸乙酯萃取物進(jìn)行成分研究，從中分離鑒定了14個(gè)化合物，包括有機(jī)酸、黃酮及萘醌等成分。其中，化合物8～9、13為首次從該植物中分離得到的，在一定程度上豐富鳳仙透骨草和鳳仙花屬植物的化學(xué)成分。本研究通過進(jìn)一步研究鳳仙透骨草抗真菌的物質(zhì)基礎(chǔ)，并篩選成分與生物活性的相關(guān)性，以期為綜合利用該植物資源提供理論依據(jù)。