松蘿酸納米混懸劑制備及其體內(nèi)藥動學(xué)研究

房 偉，王奎鵬，韓德恩

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450006)

松蘿酸主要分布于松蘿、石蕊衣、黃花島等地衣植物中，資源豐富[1]，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、麻痹鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等活性[1-3]，但該成分水溶性和脂溶性均較差[4]，不利于藥物溶解溶出及胃腸道透膜吸收，而且在體內(nèi)容易受到各種酶的代謝作用[5]，從而影響其口服生物利用度[4,6]。目前，對松蘿酸已有脂微球[7]、自微乳[8]等制劑學(xué)研究，但處方組成及制備工藝較復(fù)雜；宋婷等[4]對該成分磷脂復(fù)合物及口服藥動學(xué)進(jìn)行了研究，但其黏性較大，不利于藥物溶出，并且其口服生物利用度提高程度在109.67%～177.83%之間，具有較大的改善空間。

納米混懸劑是通過穩(wěn)定劑在某種制劑技術(shù)作用下，將難溶性藥物制成膠態(tài)藥物分散體系[9-10]，可提高藥物溶解度、溶出度、生物利用度，而且制備工藝簡單。因此，本實(shí)驗(yàn)采用高壓均質(zhì)法制備松蘿酸納米混懸劑，并考察其體內(nèi)藥動學(xué)，以期為相關(guān)制劑學(xué)研究提供參考。

1 材料

EX125DZH型電子分析天平(美國奧豪斯公司)；Mastersizer-300型粒度分析儀(英國馬爾文儀器有限公司)；安捷倫1200型高效液相色譜儀(OpenLAB CDS工作站，美國安捷倫公司)；MYP13-2S型磁力攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；ATS型均質(zhì)機(jī)(加拿大Seeker公司)；LTB-800型超聲儀(濟(jì)寧魯通超聲電子設(shè)備有限公司)；MDF-86V588D型超低溫冰箱(中科都菱設(shè)備有限公司)；H-600型透射電鏡(日本電子公司)。

松蘿酸對照品(批號190915，純度98.9%，盛世康普化工技術(shù)研究院)；松蘿酸原料藥(批號20191023，純度97%，南京天諾新材料有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K30(PVP K30，批號191207，亞什蘭集團(tuán)公司)；聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(TPGS，批號20201005，西安海斯夫有限公司)；大豆卵磷脂(批號190617，輔必成科技有限公司)；吐溫80(F1901016，上海雷允上藥業(yè)有限公司)；乳糖(批號D2101115，阿拉丁控股集團(tuán)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定松蘿酸含量

2.1.1 色譜條件 參考文獻(xiàn)[5]報道，Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相甲醇-[50 mmol/L KH2PO4-三乙胺(500∶1，超聲混勻)](70∶30)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長285 nm。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取松蘿酸對照品10 mg至量瓶中，加入5 mL三氯甲烷超聲溶解，甲醇定容至50 mL，得200 μg/mL貯備液，甲醇制成10、5、1、0.5、0.1、0.02 μg/mL溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以松蘿酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得方程為Y=13.159 3X-0.813 5(r=0.999 8)，在0.02～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取0.5 mL納米混懸劑至100 mL量瓶中，加入80 mL甲醇超聲溶解，室溫靜置30 min后定容，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取供試品溶液適量，于0、3、6、12、18、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得松蘿酸峰面積RSD為0.46%，表明溶液穩(wěn)定性良好。取同一份納米混懸劑，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得松蘿酸峰面積RSD為1.70%，表明該方法重復(fù)性良好。取10、1、0.02 μg/mL對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定6次，測得松蘿酸峰面積RSD分別為0.31%、0.25%、0.54%，表明儀器精密度良好。取0.25 mL供試品溶液至100 mL量瓶中，加入對照品溶液1.0 mL(低)、1.25 mL(中)和1.5 mL(高)，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得平均加樣回收率分別為99.07%、100.78%、100.26%，RSD分別為1.46%、1.02%、0.85%。

2.2 納米混懸劑制備 采用高壓均質(zhì)法[10]。取松蘿酸50 mg、大豆磷脂100 mg，加入10 mL丙酮，在50 ℃水浴下磁力攪拌2 h至溶液澄清，加到50 mL含有其他穩(wěn)定劑的溶液中，減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，補(bǔ)充蒸餾水至50 mL，在一定壓力下循環(huán)均質(zhì)數(shù)次，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 粒徑、PDI、Zeta電位的測定 取納米混懸劑0.2 mL，加入20 mL蒸餾水稀釋，混勻，取約3 mL至比色皿中，在粒度分析儀上測定粒徑、PDI、Zeta電位。

李公甫家里有三口人，夫妻倆，外加一個小舅子。妻子是個婦道人家，只懂洗衣做飯操持家務(wù)；小舅子卻滿腹經(jīng)綸，還酷愛鉆研醫(yī)書，但肩不能挑手不能提，目前還在家里吃閑飯。一家子都靠著李公甫來養(yǎng)活，他敢不盡心盡力地賣命工作嗎？

2.4 單因素試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝

2.4.1 穩(wěn)定劑種類 固定松蘿酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，均質(zhì)壓力70 MPa，均質(zhì)次數(shù)10次，考察PVP K30、泊洛沙姆188、吐溫80、TPGS(用量均為100 mg)對粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表1。由此可知，僅泊洛沙姆188所制備納米混懸劑的Zeta電位絕對值超過30 mV，而且粒徑、PDI最低，故選擇其作為穩(wěn)定劑。

表1 穩(wěn)定劑種類對粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)Tab.1 Effects of stabilizer type on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.2 穩(wěn)定劑用量 固定松蘿酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，均質(zhì)壓力70 MPa，均質(zhì)次數(shù)10次，考察泊洛沙姆188用量60、80、100、120 mg對粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表2。由此可知，不同用量所制備納米混懸劑的PDI均小于0.3，表明納米粒分布較為集中。當(dāng)用量較小時，乳化能力可能不足而導(dǎo)致粒徑稍大，但用量較大時粒徑反而有所上升，可能是黏度增加所致；用量為100 mg時粒徑較小，PDI最小，Zeta電位絕對值大于30 mV，故選擇其作為穩(wěn)定劑用量。

表2 穩(wěn)定劑用量對粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)Tab.2 Effects of stabilizer consumption on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.3 均質(zhì)壓力 固定松蘿酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，穩(wěn)定劑用量100 mg，均質(zhì)次數(shù)10次，考察均質(zhì)壓力50、60、70、80、90 MPa對粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表3。由此可知，隨著均質(zhì)壓力增加，粒徑有所下降，但在90 MPa時反而上升，并且PDI增加，可能是由于過大的均質(zhì)壓力會使納米體系溫度升高，導(dǎo)致納米粒子之間發(fā)生聚集甚至融合，從而粒徑增大，分布不均勻，故選擇80 MPa作為均質(zhì)壓力。

表3 均質(zhì)壓力對粒徑、PDI、Zeta電位的影響(n=3)Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size,PDI and Zeta potential (n=3)

2.4.4 均質(zhì)次數(shù) 固定松蘿酸用量50 mg，大豆磷脂用量100 mg，穩(wěn)定劑用量100 mg，均質(zhì)壓力80 MPa，考察均質(zhì)次數(shù)6、8、10、12、15次對粒徑、PDI、Zeta電位的影響，結(jié)果見表4。由此可知，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，粒徑逐漸下降，但在15次時粒徑、PDI均有升高趨勢，Zeta電位絕對值有下降趨勢，故選擇12次作為均質(zhì)次數(shù)。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，最優(yōu)制備工藝為穩(wěn)定劑(泊洛沙姆188)用量100 mg，均質(zhì)壓力80 MPa，均質(zhì)次數(shù)12次。按上述優(yōu)化工藝平行制備3批納米混懸劑，測定粒徑、PDI、Zeta電位，結(jié)果見圖1～2。由此可知，平均粒徑為185.19 nm，PDI為0.089，Zeta電位為-34.08 mV，表明該工藝重復(fù)性較好。

圖1 納米混懸劑粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of nanosuspensions

圖2 納米混懸劑Zeta電位Fig.2 Zeta potential of nanosuspensions

2.6 形態(tài)觀察 取適量納米混懸劑，蒸餾水稀釋50倍后滴至銅網(wǎng)上，1.5%磷鎢酸鈉負(fù)染，濾紙吸除多余液體，室溫晾干后在透射電鏡下進(jìn)行觀察。由圖3A可知，納米混懸劑呈球形或類球形，納米粒之間無粘連。

圖3 樣品透射電鏡圖Fig.3 Transmission electron microscopic images for samples

2.7 凍干粉制備及溶解度測定 取納米混懸劑適量，加入6%甘露醇并混勻，置于-50 ℃冰箱中預(yù)凍2 d后轉(zhuǎn)到-20 ℃真空凍干機(jī)中2 d，即得凍干粉(圖4)，密封后于干燥器中保存。取適量，蒸餾水復(fù)溶后測得其平均粒徑增加至231.42 nm，Zeta電位為-30.37 mV。

圖4 納米混懸劑凍干粉外觀Fig.4 Appearance of lyophilized powder of nanosuspensions

再采用飽和溶劑法測定溶解度。取過量松蘿酸、納米混懸劑、物理混合物(比例同納米混懸劑)，置于蒸餾水中，平行3份，分別超聲處理20 min至松蘿酸不再溶解，置于25 ℃水浴中持續(xù)磁力攪拌2 d，取上層混懸液，6 500 r/min離心20 min，HPLC法測定上清液中松蘿酸含量。結(jié)果，原料藥在水中的溶解度為6.86 μg/mL，而納米混懸劑為92.47 μg/mL，提高了13.48倍，另外物理混合物中其溶解度為12.62 μg/mL，可能是處方中表面活性劑的增溶作用所致，但提高程度遠(yuǎn)低于納米混懸劑。

2.8 體外釋藥研究 取松蘿酸、納米混懸劑、物理混合物(比例同納米混懸劑)適量(以松蘿酸計(jì)均為15 mg)，用超聲脫氣后的1%SDS溶液制成混懸液，并轉(zhuǎn)移至活化透析袋中(截留分子量8 000～14 000 Da)，以900 mL 1%SDS溶液為介質(zhì)，設(shè)定溶出儀(配置自動取樣器)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min，于設(shè)定時間點(diǎn)各取樣4 mL，并補(bǔ)充4 mL空白介質(zhì)，6 500 r/min離心20 min，HPLC法測定上清液中松蘿酸含量，繪制溶出曲線，見圖5。由此可知，納米混懸劑在60 min內(nèi)累積溶出度達(dá)90.46%，90 min內(nèi)基本溶出完全，但松蘿酸在120 min內(nèi)也僅為19.93%，另外物理混合物在一定程度上也增加了松蘿酸溶出度，但程度遠(yuǎn)低于納米混懸劑。

圖5 松蘿酸體外釋藥曲線(n=3)Fig.5 In vitro drug release curves for usnic acid (n=3)

2.9 藥動學(xué)研究

2.9.1 分組、給藥與采血 12只大鼠隨機(jī)分為松蘿酸組、納米混懸劑組，每組6只，按15 mg/kg劑量灌胃給予相應(yīng)藥物的0.5%CMC-Na混懸液(以松蘿酸計(jì)均為2.5 mg/mL)，0.5 mL飲用水沖洗灌胃針后再次灌胃給藥，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h眼眶后靜脈叢采血各約0.2 mL，血樣肝素化后立即3 500 r/min離心3 min，取上層血漿，置于-15 ℃冰箱中保存。另取6只大鼠，設(shè)置物理混合物組，同法灌胃給藥。

2.9.2 血漿處理 參考文獻(xiàn)[5]報道的方法，取含藥血漿100 μL至離心管中，加入200 μL磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，密封后渦旋30 s，加入1 mL甲醇渦旋3 min，12 000 r/min離心10 min，分離上清液至另一離心管中，氮?dú)饩徛蹈傻脷堅(jiān)?。加?00 μL甲醇后密封，渦旋30 s，進(jìn)樣測定。

2.9.3 方法學(xué)考察 取空白血漿適量，制成8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.1 μg/mL血漿對照品溶液，各取0.5 mL，按“2.9.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以峰面積(Y)對松蘿酸質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程為Y=348.21X+50.11(r=0.992 9)，在0.1～8.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

取空白血漿、含藥血漿(納米混懸劑給藥12 h后)、0.1 μg/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖6，可知血漿內(nèi)源性雜質(zhì)未對測定產(chǎn)生干擾，表明該方法專屬性良好。取8.0、2.0、0.1 μg/mL血漿對照品溶液，同一天內(nèi)在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得松蘿酸峰面積RSD分別為3.15%、4.62%、4.19%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；同法于第1、2、3、4、5、6天各進(jìn)樣測定1次，測得松蘿酸峰面積RSD分別為6.34%、8.17%、7.42%，表明該方法日間精密度良好。取含藥血漿適量，室溫下于0、2、4、6、12、24 h在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得松蘿酸峰面積RSD為7.53%，表明血漿在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取8.0、2.0、0.1 μg/mL血漿對照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣測定3次，測得松蘿酸平均加樣回收率分別為90.42%、93.67%、87.07%。

1.松蘿酸1.usnic acid圖6 松蘿酸HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of usnic acid

2.9.4 結(jié)果分析 繪制血藥濃度-時間曲線，采用3P97程序統(tǒng)計(jì)矩模型計(jì)算主要藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖7、表5。由此可知，與原料藥、物理混合物比較，納米混懸劑tmax縮短(P<0.01)，t1/2延長(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相對生物利用度提高至3.09倍；物理混合物主要藥動學(xué)參數(shù)與原料藥比較有一定改變，可能與處方中穩(wěn)定劑增溶作用有關(guān)，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖7 松蘿酸血藥濃度-時間曲線(n=6)Fig.7 Plasma concentration-time curves for usnic acid (n=6)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所用的泊洛沙姆188作為穩(wěn)定劑，可提供較大的空間阻力，防止納米混懸劑聚集[11-12]。另外，磷脂一方面發(fā)揮增溶作用，使藥物形成均一溶液；另一方面可向納米粒子提供電荷，從而增加了納米粒子之間的排斥作用[13]，提高了制劑的穩(wěn)定性，與泊洛沙姆188共同發(fā)揮了穩(wěn)定劑的作用。

表5 松蘿酸主要藥動學(xué)參數(shù)Tab.5 Main pharmacokinetic parameters for usnic acid

結(jié)果顯示，松蘿酸制成納米混懸劑后溶解度、溶出度均大幅度提高，主要與該成分比表面積明顯增加、穩(wěn)定劑增溶作用等因素有關(guān)；納米混懸劑tmax顯著縮短，可能與該制劑促進(jìn)藥物溶出、提高藥物前期溶出速率有關(guān)；文獻(xiàn)[10,14]報道，納米混懸劑可顯著延長藥物t1/2，可能是由于胃腸道環(huán)境較為復(fù)雜，影響因素較多，藥物在胃腸道內(nèi)完全溶出溶解需要一定時間，從而影響進(jìn)入血液循環(huán)的時間所致，并且納米藥物能增加與胃腸道黏膜的粘附性，可能也會對上述藥動學(xué)參數(shù)造成影響[14]；口服生物利用度顯著提高，這是因?yàn)閷⒃摮煞旨{米化后增加了其溶解度，促進(jìn)了溶出。

研究表明，納米混懸劑由于具有較小的粒徑，可增加跨膜滲透性[9,15]；穩(wěn)定劑吸附于納米藥物表面，可降低胃腸道各種酶對藥物穩(wěn)定性的影響[9]；納米藥物在伊派爾結(jié)中聚集[14-17]，通過淋巴結(jié)中的M細(xì)胞進(jìn)入體循環(huán)，從而改變吸收途徑。另外，納米混懸劑口服進(jìn)入胃腸道后可能發(fā)生聚集，導(dǎo)致粒徑變大，從而影響生物利用度提高程度。今后，本實(shí)驗(yàn)將對松蘿酸納米混懸劑的藥效學(xué)開展研究[18]，以期為該制劑開發(fā)提供更全面的資料。