非洲豬瘟檢測方法研究進展

付云龍

（河南先研生物科技有限公司，河南 鄭州 450000）

0 引言

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的一種毀滅性的豬出血熱，患病豬死亡率接近100%。由于非洲豬瘟的高發(fā)病率和高死亡率及缺乏有效的疫苗，該病原體對全球養(yǎng)豬業(yè)和國家經(jīng)濟構(gòu)成嚴重威脅。

1 ASFV

ASFV基因組是線性雙鏈DNA分子，長度在170～193 kb，包含150～167個開放閱讀框，編碼170多種蛋白。ASFV基因組有3個區(qū)域，中心區(qū)域是一個保守區(qū)域，兩側(cè)是兩個可變區(qū)域。ASFV具有多種基因型，目前已鑒定出8個血清型和24個基因型。

2 ASFV傳播及流行

ASFV可感染家豬和野豬，包括非洲疣豬、叢林豬和歐亞大陸的野豬。鳥類已被確認為ASFV的生物載體和宿主。ASFV易通過受污染的豬肉產(chǎn)品和混合飼料進行傳播。

ASF于1909年在非洲肯尼亞首次被描述，幾乎100%受感染的家豬死亡。在接下來的幾十年里，非洲豬瘟一直局限于非洲，直到1957年在葡萄牙首次發(fā)現(xiàn)，1 a后被根除，但1960年又再次暴發(fā)。1995年，除意大利的撒丁島外，歐洲多數(shù)國家通過獵殺野豬和撲殺病豬消滅了該病。該病在撒丁島一直以地方性流行病的形式存在。1971年，非洲豬瘟越過大西洋蔓延到古巴，并在加勒比和南美洲傳播，但很快得到控制并被根除。

非洲豬瘟于2007年通過高加索山脈附近的野豬群傳播到俄羅斯南部。隨后，在2008年，俄羅斯的家豬受到感染，并迅速蔓延到俄羅斯西部和北部。2014年初，非洲豬瘟通過野豬攜毒從俄羅斯傳播到歐盟國家，特別是波蘭。非洲豬瘟繼續(xù)向西南傳播，分別于2016年傳播到摩爾多瓦和匈牙利，2017年傳播到達捷克和羅馬尼亞。2018年至2020年12月，比利時、希臘和德國等歐洲國家發(fā)生了新的非洲豬瘟疫情。

2018年8月，我國首次發(fā)生非洲豬瘟。從我國分離到的菌株屬于基因型Ⅱ，與目前在俄羅斯和東歐流行的菌株相似。2018年至2020年12月，多數(shù)亞洲國家暴發(fā)非洲豬瘟，并向世界動物衛(wèi)生組織報告。

3 ASFV檢測

3.1 病原分子生物學(xué)診斷

3.1.1 聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）。傳統(tǒng)的PCR檢測是國際獸疫局認可的常規(guī)核酸檢測方法之一，并廣泛應(yīng)用于實驗室診斷。該方法具有簡便、快速、靈敏度高、特異性強及對樣品純度要求低等優(yōu)點?；赩P73基因序列的7種不同ASFV毒株，Aguero等設(shè)計了特定的引物，并建立了一種ASFV PCR鑒定方法。該方法的敏感性高于2010年世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）《診斷試驗和疫苗標準手冊》推薦的方法，適用于檢測世界范圍內(nèi)幾乎所有的ASFV毒株。蜱類在非洲豬瘟的傳播中起著重要作用，為此，研究人員建立了一種巢式PCR檢測方法，用于檢測野生蜱是否攜帶ASFV DNA。多重PCR原理與常規(guī)PCR基本相同，能夠同時檢測多種病毒而不發(fā)生交叉反應(yīng)，對豬的多種病毒感染檢測具有重要的指導(dǎo)意義。Erickson 等人建立了一種新型的伴隨自動化電子芯片檢測方法，可同時檢測豬的7種疾病，具有快速、高通量的檢測特性。多重PCR檢測的特點是可同時進行大量的生物試驗，可實現(xiàn)高通量、高速度檢測。但是，其檢出率低、成本昂貴且易交叉污染出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

3.1.2 實時熒光定量PCR（Quantitative Realtime PCR，RT-PCR）。實時熒光定量PCR是目前首選的病原檢測方法，也是ASFV檢測的金標準。該方法準確、靈敏、時間短，適合實驗室診斷。

3.1.3 等溫擴增技術(shù)。常見的ASFV等溫擴增技術(shù)有重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、交叉引物擴增（Crossing Priming lsothermal Amplification，CPA）等。RPA是由英國公司TwistDx開發(fā)的基于重組酶的等溫擴增技術(shù)，具有靈敏、快速、操作簡單等特點。LAMP是一種適用于基因診斷的新型核酸擴增技術(shù)，由日本學(xué)者Notomi于2000年開發(fā)。LAMP具有操作簡單、靈敏度高的特點，但只能作為疑似感染區(qū)的早期診斷，不能作為最終的判斷結(jié)果。CPA是一種新型核酸等溫擴增技術(shù)，無需初始變性步驟，由Ustar于2008年開發(fā)。CPA檢測具有靈敏度高、特異性強和廣泛應(yīng)用等特點，其不僅可以檢測常規(guī)血液和血清中的病毒，還可以檢測各種肉類產(chǎn)品中的病毒。

3.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷是最常用的診斷檢測方法，其操作簡單、成本相對較低，且對專用設(shè)備的要求較低。目前，ASFV的血清學(xué)檢測包括抗原檢測和抗體檢測，由于抗原檢測的條件比較嚴格，抗體檢測逐漸成為血清學(xué)診斷的主流方法。國際獸疫局推薦的ASFV抗體檢測方法為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA），并輔以其他確證檢測，如免疫印跡檢測（Immunoblotting Test，IBT）、間接熒光抗體檢測（Immunofluorescence Assay，IFA）和間接免疫過氧化物酶檢測（Indirect Immunoperoxidase Test，IPT）。

3.2.1 基于抗原的檢測

3.2.1.1 熒光抗體檢測（Fluorescent Antibody Tests，F(xiàn)AT）。FAT是常用的抗原檢測方法之一，能夠識別不吸附血液的ASFV毒株。該方法對急性感染具有檢測快速、高靈敏度、高特異性及高檢出率等優(yōu)點。FAT對亞急性和慢性ASF不敏感，原因可能是在慢性感染過程中，抗原抗體復(fù)合物競爭性地阻斷了ASFV抗原與抗體的結(jié)合，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。因此，一般FAT只作為一種輔助檢測方法。

3.2.1.2 直 接ELISA檢 測（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）?；趩慰寺】贵w涂層的直接ELISA可以直接檢測ASFV抗原，但只推薦用于急性病例檢測，其對于亞急性和慢性感染的動物，敏感性顯著降低。這可能與感染豬組織中抗原抗體復(fù)合物的產(chǎn)生有關(guān)。隨后，研究人員陸續(xù)建立了抗血清直接ELISA、基于VP73單克隆抗體的夾心ELISA、用于抗原檢測的橫向流動分析法（Lateral Flow Assay，LFA）。直接ELISA檢測是以抗ASFV蛋白P72單克隆抗體為捕集劑，其敏感性與商業(yè)抗原ELISA相似。此外，該方法可早期檢測出ASFV感染，特別適合于大規(guī)模的現(xiàn)場篩選和檢測。

3.2.2 基于抗體的檢測

3.2.2.1 間接ELISA檢測。免疫電滲電泳（Immunoelectroosmophoresis，IEOP）試驗是實驗室中最早用于診斷ASFV的血清學(xué)方法之一。IEOP試驗在檢測ASFV抗體方面優(yōu)于互補固定試驗和瓊脂凝膠擴散試驗，但需要從感染ASFV的Vero細胞提取物中制備抗原。IEOP測試費時費力，不宜應(yīng)用于大規(guī)模調(diào)查。間接ELISA具有靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點，已取代IEOP成為檢測大量血清ASFV最合適、最常用的方法。但存在因動物直接死亡或感染后存在病毒免疫復(fù)合物而導(dǎo)致的假陰性診斷問題。

如果要通過ELISA法獲得更準確的診斷結(jié)果，就必須進行更可靠的固相載體和純化抗原。Tabares等報道了半純化的ASFV主要衣殼蛋白VP73的制備，大大提高了ELISA作為包被抗原的可靠性。與半純化的P73相比，血清樣本中的ASFV抗體使用粗抗原至少提前兩天檢測。Oviedo等通過桿狀病毒表達重組蛋白P30和P54，驗證了它們在ELISA和免疫印跡試驗（IBT）中的檢測效果，認為P30更適合作為ELISA的抗原。相反，P54應(yīng)該被用作IBT的抗原。此外，將P54和P30蛋白聯(lián)合應(yīng)用于ASFV血清學(xué)診斷可提高敏感性。Filgueira等利用桿狀病毒載體在昆蟲幼蟲中建立了基于重組蛋白P30的ELISA檢測。在實驗感染動物早期檢測ASFV特異性抗體，比世界動物衛(wèi)生組織推薦的ELISA檢測更敏感。Gallardo等發(fā)現(xiàn)ASF病毒多蛋白pp62具有良好的抗原性，基于該蛋白pp62的ELISA檢測具有良好的反應(yīng)原性。特別是在檢測保存較差的樣品時，pp62的檢測準確性明顯優(yōu)于蛋白P30和P54，甚至不需要通過IBT確認結(jié)果。Gallardo等評估了4種ASFV重組蛋白（pA104R、pB602L、P54和pK205R）作為ELISA診斷工具在歐洲和非洲樣本ASFV血清學(xué)診斷中的作用。重組蛋白ELISA檢測結(jié)果與世界動物衛(wèi)生組織批準的結(jié)果一致。其中，來自東非的血清樣本具有較高的特異性，但敏感性卻很低。東非地區(qū)血清對ASFV感染反應(yīng)低的原因尚不清楚，有報道稱，不同品種的豬可能有不同的免疫譜系、克隆缺失、豬白細胞抗原類型或先天免疫機制。

3.2.2.2 間接熒光抗體（IFA）、間接免疫過氧化物酶（IPT）、斑點免疫結(jié)合試驗（Dot Immunobinding Assay，DIA）。IFA是一種快速、高靈敏度和特異性強的ASFV抗體檢測技術(shù)，適用于血清、血漿或組織分泌物中的抗體檢測。IFA檢測比ELISA檢測更敏感，可在血清學(xué)反應(yīng)早期檢測ASFV抗體。特別是在感染早期，當(dāng)感染動物幾乎沒有抗體時，IFA和IPT為血清學(xué)診斷提供了良好的選擇。IPT的原理與IFA相似，不同之處是IPT采用酶顯色系統(tǒng)，更容易判斷。

檢測血清時，因細胞中含有抗體，未感染的細胞也會發(fā)出熒光。因此，在解釋結(jié)果時可能會出現(xiàn)混淆，從而得出錯誤的診斷。Pan等開發(fā)了一種間接免疫過氧化物酶斑塊染色（Indirect Immunoperoxidase Staining，IIPS）方法。它具有IPT的所有主要特征，結(jié)果可以在普通光線下用裸眼直接讀取，每天可進行400次測試。

Pastor等人在斑點免疫結(jié)合試驗（DIA）的基礎(chǔ)上，研制了一種硝酸纖維素試紙條檢測ASFV，用于現(xiàn)場檢測抗體。DIA的工作原理與ELISA相似，將ASFV的可溶性抗原涂在硝酸纖維素試紙上，與血清樣本發(fā)生反應(yīng)。它可以通過蛋白A過氧化物酶結(jié)合物檢測抗體。與其他血清學(xué)檢測方法相比，DIACS-P具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點，可在現(xiàn)場條件下對疑似潛伏性豬瘟感染的豬進行篩選。

3.2.2.3 免疫印跡試驗（IBT）。IBT是替代IFA檢測ASFV抗體的一種方法，其靈敏度甚至優(yōu)于IFA。Kazakova等為了避免傳統(tǒng)IBT抗原中含有細胞蛋白引起的假陽性反應(yīng)及未純化的重組蛋白和原核細胞表達的蛋白對結(jié)果的影響，將蛋白P30與6xHis標簽連接，層析純化得到高純度重組蛋白P30，建立了用于ASFV血清學(xué)診斷的免疫印跡試驗方法，使檢測的特異性和敏感性得到顯著提高。

每種診斷技術(shù)都有其獨特的特點，為ASFV的診斷提供了多種選擇。有些技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，但可能受到昂貴的實驗設(shè)備的限制，如PCR和FAT。一些診斷技術(shù)，如ELISA，敏感性和特異性較差，但成本較低。ASFV常規(guī)實驗檢測技術(shù)的特點如表1所示。

表1 ASFV常規(guī)實驗檢測優(yōu)缺點

4 討論和結(jié)論

非洲豬瘟給養(yǎng)豬業(yè)和世界經(jīng)濟造成了嚴重損失，由于目前沒有可用的疫苗，非洲豬瘟的預(yù)防和控制已成為最緊迫和最難解決的問題。目前，非洲豬瘟防控是早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處理，這是控制和根除非洲豬瘟的重要手段。近年來，ASFV的診斷方法得到了多種發(fā)展，并顯示出良好的診斷效果。

PCR和Real-time PCR仍是診斷ASFV感染最可靠的方法，其中Real-time PCR被認為是金標準。等溫擴增技術(shù)抵消了昂貴的實驗室設(shè)備的限制，但其敏感性和有效性仍需通過大量的臨床診斷數(shù)據(jù)進行驗證。等溫擴增技術(shù)與CRISPR-Cas12a的結(jié)合也具有良好的發(fā)展?jié)摿ΑLISA具有檢測快速、操作簡單、成本相對較低的優(yōu)點，是目前應(yīng)用最廣泛的ASFV檢測方法。ELISA適用于急性病例，對慢性病例的檢出率不高。因此，對于ELISA檢測陽性的樣品，建議采用核酸檢測、免疫印跡或間接熒光抗體檢測進行確認。目前，商用的ELISA試劑盒主要基于蛋白P30、P54、P72和pp62，其中蛋白P30被認為是最適合用于免疫吸附試驗的。目前，基于ASFV抗原檢測的側(cè)流裝置已經(jīng)研制成功。另外，等溫擴增技術(shù)是21世紀新興的核酸擴增技術(shù)。該技術(shù)基本滿足了目前現(xiàn)場對ASFV檢測的需求，在現(xiàn)場診斷中具有很大的應(yīng)用前景。但是，這種方法是單通道檢測，很難實現(xiàn)數(shù)百個或數(shù)千個樣本的同時檢測。鑒于此，以多通道快速檢測為例，結(jié)合電子芯片技術(shù)將成為該技術(shù)未來的發(fā)展方向。