Mibefradil可改善肥胖小鼠骨骼肌的質(zhì)量、功能和結(jié)構(gòu)

肌少癥以骨骼肌力量及質(zhì)量下降為特征。除年齡因素外，骨骼肌細(xì)胞去神經(jīng)支配、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、營養(yǎng)障礙、廢用、肥胖以及內(nèi)分泌改變等多種原因均可導(dǎo)致肌少癥的發(fā)生。肥胖引起的異位脂肪沉積會(huì)導(dǎo)致骨骼肌生物功能改變，包括胰島素抵抗、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥等。這些改變進(jìn)一步加劇了骨骼肌的丟失和身體功能障礙?；加屑∪鉁p少癥的老年人更容易發(fā)生跌倒、骨折等不良事件，生活質(zhì)量隨之下降，死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。肥胖引起的脂肪沉積會(huì)增加代謝性疾病、心血管疾病、阿爾茨海默病、抑郁癥和癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，老年肌少性肥胖人群與單純少肌癥或肥胖患者比較，患代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。臨床研究發(fā)現(xiàn)肌少性肥胖患者的疾病負(fù)擔(dān)比只患有肥胖癥或肌少癥患者更加嚴(yán)重。目前關(guān)于肌少性肥胖發(fā)生機(jī)制的探究也引起學(xué)界的廣泛關(guān)注。

水庫在遭遇防洪標(biāo)準(zhǔn)以內(nèi)洪水時(shí)，應(yīng)該考慮下游河道安全，實(shí)行控泄，使下泄流量小于等于河道安全泄量。因?yàn)橄鹉z壩未安裝，防洪能力不足，而且下游河道行洪能力較差，當(dāng)來水量大于下游河道現(xiàn)狀承受能力時(shí)，水庫無法使泄量小于河道過流能力。如果降低汛限水位，增大水庫防洪能力，興利用水將受到影響。

Mibefradil是一種選擇性T型鈣通道拮抗劑。T型鈣通道是一種激活電位低、失活快的電壓門控通道，參與受精、神經(jīng)元放電、激素分泌和肌纖維發(fā)育等多種生理過程。研究發(fā)現(xiàn)T型鈣通道在融合前表達(dá)于成肌細(xì)胞，在終末分化成肌細(xì)胞的鈣離子流動(dòng)中起重要作用。高脂飲食會(huì)引起肌肉內(nèi)脂肪過度沉積，引起肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制T型鈣通道可以抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加。也有研究顯示mibefradil可以改善糖尿病小鼠的糖代謝；mibefradil可以抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬。但目前關(guān)于mibefradil對(duì)肥胖小鼠骨骼肌的影響尚未見報(bào)道，因此，本研究目的在于探討mibefradil對(duì)肥胖小鼠骨骼肌的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

Mibefradil（MCE），P62 抗體（Abways），LC3 B抗體（Bimake），GAPDH抗體（武漢三鷹公司），山羊抗兔Ig G-HRP（北京中杉金橋公司）山羊抗小鼠Ig G-HRP（北京中杉金橋公司），電子抓力儀（cat.47200,Ugo Basil），雙 能X 線吸光測定儀器（Discovey A，HOLOGIC），甘油三酯試劑盒（南京建成），總膽固醇試劑盒（南京建成），蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（武漢賽維爾生物公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

15只SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠（浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），將小鼠隨機(jī)分成3組（5只/組）：普通飲食組（Control組，普通飲食，能量比為10%脂肪、20%蛋白質(zhì)和70%碳水化合物），高脂飲食組（HFD組，高脂飲食，能量比為60%脂肪、20%蛋白質(zhì)和20%碳水化合物），高脂飲食加mibefradil 干預(yù)組（HFD+Mibe組）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物護(hù)理規(guī)程進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠分籠飼養(yǎng)，5只/籠，自由飲水、飲食，飼養(yǎng)在恒溫22±2 ℃、相對(duì)濕度為60%的環(huán)境中，每周定時(shí)清理鼠籠、更換墊料，添加飼料，12 h明暗周期。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程已通過重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.3 給藥方法

肌肉質(zhì)量和肌纖維大小由肌纖維內(nèi)蛋白質(zhì)合成與分解之間的平衡調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)過度分解會(huì)造成蛋白質(zhì)平衡失調(diào)，引起肌肉萎縮。自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到，基礎(chǔ)水平的自噬能清除受損細(xì)胞器和異常蛋白，對(duì)細(xì)胞是一種保護(hù)性作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞過度自噬，會(huì)導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生。間歇性低氧干預(yù)小鼠會(huì)導(dǎo)致自噬被過度激活，最終導(dǎo)致膈肌萎縮，表明自噬的過度激活也會(huì)引起自噬性細(xì)胞死亡甚至加速疾病發(fā)展。LC3和P62是常用的自噬檢測標(biāo)志物，LC3蛋白有兩種存在形式LC3I和LC3 Ⅱ，LC3I主要在胞漿分布，自噬激活過程中，LC3I與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合成為LC3 Ⅱ，而后者是自噬小體的主要成分，LC3 Ⅱ的表達(dá)量與自噬體的數(shù)量成正相關(guān)，LC3 Ⅱ表達(dá)水平升高提示自噬激活，P62分子參與連接自噬體膜與靶分子或細(xì)胞器，并隨自噬體降解而降解，P62表達(dá)水平升高提示自噬活動(dòng)降低。因此本研究首先通過免疫熒光技術(shù)檢測各組小鼠骨骼肌細(xì)胞中LC3的變化，結(jié)果顯示：HFD組和HFD+Mibe組的LC3均勻分布于細(xì)胞漿，呈淺淡紅色熒光，表明主要以LC3I的形式存在，自噬未被激活；而在HFD組檢測到不同程度的明亮斑點(diǎn)狀紅色熒光，表明LC3I轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ，自噬被激活。我們進(jìn)一步檢測LC3 Ⅱ和P62蛋白在各組中的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)高脂飲食和mibefradil對(duì)骨骼肌自噬的影響，結(jié)果顯示：肥胖小鼠肌肉組織中LC3 Ⅱ蛋白的表達(dá)水平較普通飲食組小鼠升高，P62蛋白表達(dá)水平較普通飲食組小鼠降低，表明肥胖小鼠肌肉組織中自噬活動(dòng)增強(qiáng)，因此我們推測高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠會(huì)出現(xiàn)過度自噬，引起肌細(xì)胞蛋白質(zhì)分解加劇，造成蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而出現(xiàn)肌肉萎縮，抓力降低。給予mibefradil干預(yù)后，觀察到肥胖小鼠的抓力增強(qiáng)，肥胖小鼠肌肉組織中LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)水平降低，P62蛋白表達(dá)水平升高。自噬的調(diào)控有多種信號(hào)通路參與，AKT/mTOR信號(hào)通路是其中之一，AKT 作為mTOR的上游分子，能正向調(diào)節(jié)mTOR的表達(dá)，mTOR是自噬主要的負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白，失活后可導(dǎo)致自噬水平升高。但mibefradil介導(dǎo)的自噬是否與AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)未見報(bào)道，本研究通過Western blot檢測AKT/mTOR信號(hào)通路的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Con組小鼠相比，HFD組小鼠肌肉中p-AKT和p-mTOR表達(dá)降低；肥胖小鼠進(jìn)行mibefradil干預(yù)后，p-AKT和p-mTOR的表達(dá)升高，表明mibefradil可能通過激活A(yù)KT/mTOR信號(hào)通路抑制過度自噬從而改善肥胖小鼠的肌肉功能障礙。

1.4 小鼠前肢抓力的測量

HE染色的腓腸肌橫切面顯示，Control組和HFD+Mibe組小鼠肌纖維呈不同形狀的塊狀，排列緊密；而高脂組肌纖維排列疏松。HFD組平均肌纖維橫截面積低于Control組（＜0.05），而HFD+Mibe組平均肌纖維橫截面積較HFD組升高（＜0.05，圖2）。

1.5 雙能X射線吸收測定（DXA）試驗(yàn)

通過相對(duì)抓力及抓力/體質(zhì)量評(píng)估肌肉的力量，結(jié)果顯示，與Con組相比，HFD組相對(duì)抓力下降，與HFD組相比，HFD+Mibe組小鼠相對(duì)抓力以及后肢肌肉比率明顯升高（＜0.05）。脂代謝指標(biāo)檢測顯示，與Con組相比，HFD組甘油三酯和總膽固醇升高，與HFD組相比，HFD+Mibe組小鼠甘油三酯和總膽固醇明顯下降（＜0.05，表1）。

與Control組小鼠相比，HFD組小鼠體質(zhì)量增加明顯（圖1），HFD組小鼠肥胖度均超過20%，平均36.1%，高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠模型成功。HFD+Mibe組與HFD組的體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，mibefradil干預(yù)能降低肥胖小鼠的體質(zhì)量增加（＜0.05，表1）。

1.6 組織制備和組織學(xué)分析

喂養(yǎng)13周后，所有小鼠經(jīng)水合氯醛聯(lián)合戊巴比妥鈉進(jìn)行深度麻醉，通過摘眼球取血。然后，所有樣品進(jìn)行離心保留血清（4 ℃，3000 g，10 min）。用酶標(biāo)儀通過GPO-PAP法測定甘油三酯和總膽固醇水平。處死小鼠，取出腓腸肌放入40 g/L多聚甲醛中性溶液中固定24 h。然后用石蠟包埋后，切成4～6 μm厚的切片。切片用進(jìn)行熒光以及蘇木精伊紅染色，然后在顯微鏡下觀察記錄。用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.7 Western blot

提取各組肌肉組織總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。等量上樣至SDS-PAGE凝膠中，電泳電壓設(shè)置為60 V 出孔后轉(zhuǎn)120 V，100 min。蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，快速封閉液室溫封閉1 h，將膜分別置于溶有LC3 B、P62 和GAPDH 的一抗稀釋液中4 ℃過夜。第2天用TBST洗膜3次，10 min/次，將膜轉(zhuǎn)入已稀釋的二抗中室溫1 h，再次用TBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL顯影，調(diào)節(jié)Bio-1D軟件（VilberLourmat，法國）凝膠成像儀的參數(shù)進(jìn)行曝光，采圖。Image J軟件分析，測定并計(jì)算出LC3 Ⅱ、P62和GAPDH條帶灰度值比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

通過間接免疫熒光技術(shù)在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，LC3I主要分布在細(xì)胞漿，自噬激活后LC3I共價(jià)結(jié)合磷脂酰乙醇胺變?yōu)長C3Ⅱ，在免疫熒光中表現(xiàn)為彌散分布的LC3變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集分布。細(xì)胞核顯藍(lán)色熒光，LC3顯紅色熒光（圖3）。HFD組和HFD+Mibe組的LC3均勻分布于細(xì)胞漿，呈淺淡紅色熒光，即主要以LC3I的形式存在；而在HFD組檢測到不同程度的明亮斑點(diǎn)狀紅色熒光。HFD組與Control組、HFD+Mibe組與HFD組熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，圖3）。

2 結(jié)果

2.1 Mibefradil對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量、肌肉質(zhì)量、相對(duì)抓力和脂代謝指標(biāo)的影響

2.4 OSCE考試方案考生反饋 考試結(jié)束后，共發(fā)放自設(shè)調(diào)查問卷162份，回收162份，回收率100%。61.3%的考生對(duì)考試所提供的場所、設(shè)施及考場服務(wù)滿意。21.4%的考生在考試之前對(duì)OSCE有所了解，45.12%的考生認(rèn)為本次OSCE考試人文護(hù)理溝通考站最難，但能夠考查自身的溝通交流能力。52.3%的考生認(rèn)為臨床思維考站最簡單。41.5%的考生認(rèn)為SP能夠形象的模擬臨床患者。78.3%的考生認(rèn)為考試總體難度一般，有助于促進(jìn)臨床技能及理論知識(shí)的掌握。從調(diào)查問卷可以看出，大部分考生認(rèn)可OSCE考試，認(rèn)為考核方式新穎、客觀，能夠促進(jìn)理論知識(shí)的學(xué)習(xí)及臨床技能的掌握，值得推廣。

小鼠用4%水合氯醛（0.1 mL/100 g）聯(lián)合戊巴比妥鈉麻醉后俯臥在掃描儀床上。掃描結(jié)束后，記錄小鼠體質(zhì)量和瘦質(zhì)量，并計(jì)算出小鼠后肢肌肉比率。

2.2 Mibefradil對(duì)肥胖小鼠骨骼肌肌纖維橫截面積的影響

將小鼠前肢放置在電子抓力儀的感應(yīng)桿上，待小鼠緊緊抓住感應(yīng)桿后，拉住小鼠尾巴并向后拉，直到松開為止，記錄小鼠的抓力。重復(fù)測量3次，取最大值為小鼠的絕對(duì)抓力，測量1次/周。同時(shí)使用電子體重稱測量小鼠體質(zhì)量。

2.3 各組小鼠肌肉組織LC3免疫熒光

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad Prism 8、Image J 和SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用重復(fù)測量方差分析比較小鼠體質(zhì)量及抓力的變化。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用最小顯著差異法（LSD法），＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2.4 Mibefradil對(duì)肥胖小鼠P62、LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)水平以及AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

HFD 組中P62 蛋白表達(dá)水平低于Control 組和HFD+Mibe組（＜0.05）；HFD組中LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)水平高于Control組和HFD+Mibe組（＜0.05，圖4）。與Control組相比，HFD 組信號(hào)通路 蛋白p-AKT 和pmTOR 表達(dá)下降；給與mibefradil 干預(yù)后p-AKT 和pmTOR表達(dá)升高（＜0.05，圖5）。

3 討論

研究表明，肥胖引起血液游離脂肪酸濃度升高，此時(shí)骨骼肌的脂肪酸攝入增加而氧化能力下降，因此脂肪在骨骼肌中大量沉積，造成線粒體脂質(zhì)負(fù)荷增加，骨骼肌的胰島素敏感性改變，出現(xiàn)胰島素抵抗，進(jìn)而引起肌肉結(jié)構(gòu)改變。甘油三酯、總膽固醇、血糖、體質(zhì)量指數(shù)等代謝危險(xiǎn)因素均與肌少癥相關(guān)。本研究顯示，給予高脂喂養(yǎng)的小鼠體質(zhì)量增加明顯，相對(duì)抓力降低，后肢肌肉比率下降，通過HE染色檢測進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)骨骼肌肌纖維平均橫截面積減小。表明高脂喂養(yǎng)的小鼠會(huì)出現(xiàn)肥胖并伴有肌肉質(zhì)量減少和功能障礙。對(duì)肥胖小鼠進(jìn)行mibefradil干預(yù)后，結(jié)果顯示小鼠體質(zhì)量減輕，相對(duì)抓力、后肢肌肉比率及肌纖維橫截面積升高，同時(shí)對(duì)各組小鼠的脂代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)的小鼠甘油三酯和總膽固醇濃度較普通飲食小鼠增高，而HFD+Mibe 組甘油三酯和總膽固醇濃度較HFD 組低，表明mibefradil干預(yù)可以減輕肥胖引起的肌肉損失和功能障礙，可能與抵抗高脂誘導(dǎo)的肥胖和改善脂代謝有關(guān)。有研究報(bào)道，mibefradil可以抑制饑餓誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬，結(jié)合課題組前期發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)的小鼠肌肉中LC3 Ⅱ蛋白表達(dá)水平升高，我們推測自噬可能在該過程中發(fā)揮重要作用。

HFD+Mibe組給予mibefradil 30 mg/（kg·d）（用生理鹽水溶解）干預(yù)2周，普通飲食組及高脂飲食組給予等體積生理鹽水，給藥方式均為腹腔注射，分早晚兩次給藥。

ICMI還有一些附屬的研究組和國際或跨國的組織，如數(shù)學(xué)史與數(shù)學(xué)教學(xué)的關(guān)系國際研究小組（簡稱HPM）、國際數(shù)學(xué)教育心理學(xué)研究小組（簡稱PME）、數(shù)學(xué)建模和應(yīng)用國際研究小組（簡稱ICTMA）、國際數(shù)學(xué)競賽聯(lián)盟（簡稱WFNMC）、國際數(shù)學(xué)教學(xué)研究與改進(jìn)研究會(huì)（簡稱CIEAEM）等．

線上線下混合教學(xué)培訓(xùn)模式就是要把傳統(tǒng)的線下學(xué)習(xí)方式（面授教學(xué) ）和線上學(xué)習(xí)方式（數(shù)字化或網(wǎng)絡(luò)化學(xué)習(xí)）的優(yōu)勢結(jié)合起來。

綜上所述，mibefradil可抵抗高脂飲食誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加，改善肥胖小鼠肌肉質(zhì)量與功能，其作用機(jī)制可能與改善脂代謝和抑制AKT/mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)，但mibefradil對(duì)肌肉產(chǎn)生的作用及相關(guān)機(jī)制十分復(fù)雜，仍有待進(jìn)一步研究。

體育作為人的實(shí)踐活動(dòng)，對(duì)體育的研究，就是對(duì)人的系列問題的追問與省思。探索體育與人存在的關(guān)系，應(yīng)從人的本質(zhì)屬性入手。馬克思人學(xué)存在論解釋了人的存在問題，人在感性存在、現(xiàn)實(shí)生存、實(shí)踐發(fā)展與完整追求中與體育建立多維度聯(lián)系。體育在“感性的人”中出場，以“現(xiàn)實(shí)的人”為起點(diǎn)，關(guān)照“實(shí)踐的人”的價(jià)值，終極回歸到“全面發(fā)展的人”，體育促進(jìn)人的全面發(fā)展，使人得以完整，成為哲學(xué)文化的必要補(bǔ)充，是省思人之為人的價(jià)值所向。本文以馬克思人學(xué)存在論為理論依據(jù)，對(duì)體育與人的關(guān)系進(jìn)行了多維省思。