表達(dá)工程化剪接因子腺病毒的構(gòu)建及其在調(diào)控乳鼠心肌細(xì)胞中的YAP11可變剪接中的應(yīng)用

在基因表達(dá)的過程中選擇性剪接是一步非常關(guān)鍵調(diào)控步驟，其剪接的多樣性給人的健康帶來十分重要的影響。通過選擇性剪接，大多數(shù)基因會產(chǎn)生多種剪接亞型，具有相反的功能。在組織發(fā)育過程中，剪接異構(gòu)體的選擇在不同組織中受到嚴(yán)格調(diào)控，這種調(diào)控遭到破壞是人類疾病發(fā)生的常見原因之一?？勺兗艚釉诓±砩磉^程中發(fā)揮重要作用，探討特異性調(diào)節(jié)選擇性剪接的新方法，將提高我們對剪接調(diào)節(jié)的理解，將有助于剪接調(diào)控相關(guān)疾病的治療。

可變剪接過程通常是順式作用元件通過募集反式作用剪接因子，來進(jìn)行調(diào)節(jié)。這些順式作用元件通過招募反式作用剪接因子，可以影響剪接位點(diǎn)的使用。反式剪接因子包含兩大類，一類是富含絲氨酸/精氨酸的蛋白質(zhì)（SR 蛋白），另一類是異質(zhì)核核糖核蛋白（HnRNPs）。SR 蛋白含有N末端RNA 識別基序（RRM）和C端的RS 結(jié)構(gòu)域。其 中RRM能與mRNAs前體中的外顯子剪接增強(qiáng)子結(jié)合，使得C-末端精氨酸/絲氨酸結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮剪接調(diào)控作用，促進(jìn)外顯子剪入。

在RNA結(jié)合蛋白中，人Pumilio1的PUF結(jié)構(gòu)域與同源RNA序列緊密結(jié)合。它包含8個PUF重復(fù)序列，能夠分別識別8個連續(xù)的RNA堿基序列。通過改變這些PUF重復(fù)結(jié)構(gòu)域，可以改變它們結(jié)合的RNA序列。因此可以設(shè)計一個PUF結(jié)構(gòu)域來特異性結(jié)合大多數(shù)8-核苷酸RNAs。因?yàn)镻UF蛋白本身是缺乏額外的功能模塊，只有通過蛋白質(zhì)之間的相互融合，才能形成RNA功能域，組裝成識別特定序列，并具有相應(yīng)功能的人工生物分子；從而可以按照想要靶向的序列，設(shè)定人工化的RNA操控分子。

本研究通過合成生物學(xué)的方法，將這些序列特異的PUF結(jié)構(gòu)域與剪接效應(yīng)域構(gòu)建融合蛋白，可以設(shè)計結(jié)合特定RNA序列，具有模塊化的剪接因子。基于這一原理，2009年，北卡大學(xué)教堂山分校（UNC-CH）的王澤峰課題組基于可編程的RNA結(jié)合蛋白PUF構(gòu)建了第一個可以進(jìn)行RNA剪接調(diào)控的人工剪接因子。2018年，吳嘉煒課題組通過修改了PUF結(jié)構(gòu)域，使其識別不同的RNA靶標(biāo)，來構(gòu)造了人工RNA結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)9個和10個重復(fù)序列，對RNA的結(jié)合力最高。但是，通過9個和10個重復(fù)序列構(gòu)建的人工RNA剪接因子對可變剪接的調(diào)控方面，并不優(yōu)于8個重復(fù)序列構(gòu)建的人工RNA剪接因子。2021年，大連醫(yī)科大學(xué)的汪洋課題組，設(shè)計了PUF人工蛋白來促進(jìn)circRNA的形成。以上的幾個研究證實(shí)了通過PUF序列進(jìn)行人工剪接因子的構(gòu)造和促進(jìn)circRNA產(chǎn)生。但是將PUF蛋白轉(zhuǎn)染到細(xì)胞過程總是會會產(chǎn)生脫靶和過表達(dá)等問題，因此本文通過腺病毒為載體將其應(yīng)用到SD大鼠的心肌細(xì)胞中來調(diào)節(jié)PUF蛋白的可變剪接，使其能夠特異性指向目標(biāo)蛋白和調(diào)控剪接。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

磷酸緩沖溶液（賽默飛）、RNA提示劑、三氯甲烷（西亞化學(xué)）、異丙醇（默克）、75%乙醇（阿拉?。㈦p蒸水、膠原酶I（優(yōu)寧維）、DMEM培養(yǎng)基（賽默飛）、10%小牛血清（賽默飛）、TBST溶液（默克）、質(zhì)粒（譜新）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（聯(lián)邁生物）、心肌細(xì)胞免疫鑒定盒（醫(yī)諾生物）、Actinin一抗，α-Actinin(D6F6)XP Rabbit mAb（CST）、二抗：Anti-rabbit IgG(H+L)，F(xiàn)(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 555 Conjugate)（CST）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

根據(jù)靶向的堿基序列，通過PCR法構(gòu)建PUF重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域R1-R8，將其與NLS序列和SR序列相連接后克隆到pAd-Track載體上，并使用腺病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞中。通過熒光染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到腺病毒對心肌細(xì)胞有近乎100%的轉(zhuǎn)染效率（圖3A上）。與此同時通過載體轉(zhuǎn)染法對質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染作為對照（圖3A下），但是在細(xì)胞內(nèi)并沒有發(fā)現(xiàn)綠色的熒光蛋白。這也證實(shí)通過腺病毒構(gòu)建人工剪接因子的優(yōu)越性。通過Western blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出陰性對照組即野生型PUF-SR 和6 個靶向YAP1 Exon6 序列的Flag-SRNLS-PUF都能夠檢測到融合Flag的蛋白的表達(dá)（圖3B）。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

吸除心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液，0.1 mol/L 的PBS清洗2次后按MOI 值1∶20計算，加入Flag-SR-NLS-PUF腺病毒液體，對照組加入0.1 mol/L PBS，感染1 h 后吸除各組細(xì)胞的上清液，PBS 清洗2 次，加入含有血清的DMEM中，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RNA抽提

本研究使用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法檢測YAP1可變剪接調(diào)控原代心肌細(xì)胞的情況，結(jié)果顯示針對YAP1的第4個target序列，所構(gòu)建的腺病毒，在心肌細(xì)胞中能有效調(diào)控YAP1 的可變剪接，使得Exon 6 的剪入增加（圖4A）。同時還設(shè)計了YAP1不同剪接亞型的定量PCR檢測方法（圖4B），檢測了Flag-SR-NLS-PUF對YAP1可變剪接的調(diào)控作用，結(jié)果顯示針對YAP1 的第4 個target序列所構(gòu)建的人工剪接因子能夠有效調(diào)控YAP1 Exon 6的剪入。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

取1 μg 總RNA，按照說明書配反轉(zhuǎn)錄體系，采用SSIII進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：42 ℃15 min；95 ℃5 min；16 ℃保持。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用雙蒸水稀釋10倍后，作為PCR的cDNA模板。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳進(jìn)行分離。熒光定量PCR采用Sybgreen法。通過熒光信號獲得目的基因的CT值，以GAPDH或U6為內(nèi)參，通過2的方法計算目的基因的相對表達(dá)量。

2．移植瘤組織凋亡相關(guān)分子的mRNA表達(dá)：MET組、GEM組以及MET+GEM組Bcl-xl、Survivin mRNA表達(dá)較對照組明顯下調(diào)，而Bax、caspase3 mRNA的表達(dá)較對照組明顯升高(P<0.05)，MET+GEM組較單藥組的這一作用更為顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05，表2、圖2)。

1.6 腺病毒構(gòu)建

YAP1作為一個轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠與TEAD1等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過程。本研究前期發(fā)現(xiàn)，YAP1在體內(nèi)的多個部位存在著可變剪接。因此通過半定量PCR法在Exon5和Exon7設(shè)計引物以檢測其可變剪接的情況。凝膠電泳結(jié)果的結(jié)果顯示包含兩種YAP1剪接亞型，一種亞型包含Exon6，一種亞型不包含Exon6（圖2A）。針對Exon6的48個堿基序列，本研究選擇連續(xù)8個堿基作為PUF結(jié)構(gòu)域的作用序列，一共選擇6段序列，進(jìn)行PUF合成（圖2B）。

1.7 腺病毒的轉(zhuǎn)染

出生3 d的SD 乳鼠，75%酒精消毒皮膚，剪開胸腔，取出心室，迅速置入預(yù)冷的無鈣鎂離子平衡鹽溶液中，用鑷子去除心房后，將心室剪成1 mm左右的組織碎塊。用0.1%的膠原酶，4 ℃消化組織塊，過夜。次日，1 mL移液器吹打組織塊，將其吹散，以1000 r/min 離心15 min，棄上清，沉淀以全培液重懸。差速貼壁2 h，分離心肌成纖維細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)后，以3×10-5×10/mL密度接種于6孔板中，5%CO孵箱、37 ℃培養(yǎng)。24 h 后換成含10%小牛血清和0.1 mmol/L BrdU的DMEM培液，以抑制摻雜的少量非心肌細(xì)胞增殖，繼續(xù)孵育48 h后，換成不含血清DMEM溶液。心肌細(xì)胞無血清培養(yǎng)12 h后，觀察細(xì)胞表型及提取蛋白。

1.8 Western blot

蛋白樣品經(jīng)BCA法定量后，加入SDS裂解液，超聲處理后，沸水浴煮5 min，于冰上靜置2 min，用于后續(xù)Western blot 檢測。配制PAGE 蛋白分離膠與濃縮膠后，100 V電壓預(yù)電泳15 min。蛋白樣品按每孔40 μg的量進(jìn)行上樣，100 V凝膠電泳10 min后，120 V 電泳到溴芬蘭至膠底。電泳結(jié)束后，100 V轉(zhuǎn)膜2 h。將膜用5%牛奶封閉2 h后，置于4 ℃冰箱的搖床上，與TBST稀釋的一抗α-Actinin(D6F6)XP Rabbit mAb以1∶1000孵育過夜。次日，室溫下將膜用TBST清洗4次，8 min/次。將膜置于用5%牛奶以1∶1000稀釋的二抗Anti-rabbit IgG(H+L)，F(xiàn)(ab')2 Fragment中，室溫孵育2 h，室溫下將膜用TBST清洗4次，8 min/次。ECL顯影，獲得蛋白表達(dá)信號。

集團(tuán)主任陳海嘯結(jié)合十五年來醫(yī)院形成的綜合立體、具有恩澤特色的精益持續(xù)改進(jìn)模式和其自身十八年間對精益與醫(yī)院管理的學(xué)習(xí)、理解、融合，從戰(zhàn)略實(shí)施角度，為精益醫(yī)療的落地與實(shí)踐摸索了一套“恩澤式”經(jīng)驗(yàn)與思路。

1.8 心肌細(xì)胞鑒定

基于以上優(yōu)勢，寧夏具備大力發(fā)展人身險業(yè)務(wù)的契機(jī)，可針對沿線國家的風(fēng)險特點(diǎn)，為“走出去”的企業(yè)提供風(fēng)險咨詢服務(wù)，加強(qiáng)對“一帶一路”沿線國家和地區(qū)的政策及形勢研判，切實(shí)做好風(fēng)險管控，并為境外務(wù)工人員提供更加全面的保障，為“走出去”企業(yè)減輕后顧之憂；在加強(qiáng)與中東、中亞等地區(qū)在石油、天然氣、煤炭和新能源等方面的國際合作中，可配套提供意外險、健康險等產(chǎn)品及服務(wù)，進(jìn)一步提供完備的保障；在一帶一路沿線國家構(gòu)建保險服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，加快建設(shè)海外承保、理賠作業(yè)、救援等境外服務(wù)網(wǎng)絡(luò)，為服務(wù)“一帶一路”建設(shè)提供有效網(wǎng)絡(luò)依托，加強(qiáng)國際合作，推進(jìn)保險業(yè)國際化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較進(jìn)行檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 合成PUF-剪接因子來調(diào)控RNA可變剪接的原理

8 個PUF 重復(fù)蛋白結(jié)構(gòu)域，可以識別8 個連續(xù)的RNA堿基。PUF結(jié)構(gòu)域和RNA之間的相互作用如晶體結(jié)構(gòu)和圖表所示。PUF重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域R1-R8分別識別核苷酸N8-N1（圖1A）。我們通過ASF的富含精氨酸/絲氨酸（SR）結(jié)構(gòu)域與PUF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行融合，設(shè)計一個Flag-SR-NLS-PUF結(jié)構(gòu)域重組質(zhì)粒載體。理論上，在細(xì)胞內(nèi)，它可以表達(dá)一個帶有核定位序列、剪接激活域和RNA結(jié)合域的蛋白，其中RNA結(jié)合域可以根據(jù)要識別的RNA序列進(jìn)行靈活設(shè)計（圖1B）。

因此，泥石流災(zāi)害防治工作應(yīng)嚴(yán)格按《地質(zhì)災(zāi)害防治條例》和《國家突發(fā)地質(zhì)災(zāi)害應(yīng)急預(yù)案》開展，列入各級政府和國土資源行政主管部門主要職責(zé)之一。在部分縣（市），泥石流災(zāi)害嚴(yán)重的鄉(xiāng)村可設(shè)地質(zhì)災(zāi)害監(jiān)測員。在村級等基層組織，應(yīng)明確應(yīng)急管理職責(zé)和任務(wù)，配備必要的應(yīng)急救援設(shè)備?；鶎咏M織針對本地多發(fā)的災(zāi)害或事故制定相應(yīng)的應(yīng)急預(yù)案，確定災(zāi)害或事故發(fā)生后的撤離路線。

2.2 YAP1在細(xì)胞中存在可變剪接，初步篩選調(diào)控YAP1可變剪接的作用序列

將人工化的PUF-SR的PCR片斷克隆到pAd-Track質(zhì)粒中。將pAd-Track-PUF-SR質(zhì)粒用PmeⅠ酶切后，轉(zhuǎn)染BJ5183感受態(tài)菌進(jìn)行同源重組，卡鈉板挑選克隆后，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，PacⅠ酶切確認(rèn)后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，獲得pAd-easy-PUF-SR質(zhì)粒；將其線性化后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，獲得第1代腺病毒。將第1代腺病毒按10 MOI滴度，多次轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，獲得較高滴度的病毒液。將純化好的病毒原液稀釋10 000倍，然后10倍梯度依次稀釋，分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37 ℃孵育24 h，熒光顯微鏡觀察表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)，確定病毒滴度。

心肌細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。貼壁后，吸去培養(yǎng)液，PBS漂洗細(xì)胞爬片。然后將其置于37 ℃，5%CO的培養(yǎng)箱中孵育45 min。然后吸出PBS。加組織固定液室溫固定12 min。吸去固定液，加PBS液洗3次，5 min/次。棄PBS液，0.2%Triton X-100 室溫通透5 min，吸去通透液，加入PBS液漂洗3次，5 min/次。5%羊血清室溫封閉2 h，吸去封閉液，滴加1∶100稀釋（稀釋液1%羊血清）的α-Actinin（D6F6）XP Rabbit mAb αactinin 抗體。4 ℃過夜。用自制針頭小鉤取出細(xì)胞爬片，PBS 液漂洗6 次，5 min/次。滴加二抗[Anti-rabbit IgG(H+L)，F(xiàn)(ab')2 Fragment，1∶200稀釋]。蓋好封口，37 ℃避光孵育1.5 h。吸去二抗，PBS液漂洗4次，5 min/次。取出爬片，蒸餾水清洗，DAPI封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2.3 構(gòu)建Flag-SR-NLS-PUF腺病毒對心肌細(xì)胞有較高的轉(zhuǎn)染效率

出生3 d 的SD乳鼠，體質(zhì)量22 g 左右，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司［實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0008］。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)條件：室溫（18～22 ℃），維持正常晝夜節(jié)律（12 h/12 h），自由進(jìn)食、飲水。動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)（第二軍醫(yī)大學(xué)）動物倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（SYXK 2020-01-015）。

“中國風(fēng)”指“三古三新”結(jié)合的中國獨(dú)特曲風(fēng)。而典型“中國風(fēng)”歌詞多運(yùn)用修辭手法，其中尤其以“用典”手法的應(yīng)用最為突出。

2.4 轉(zhuǎn)染PUF-SR腺病毒到心肌細(xì)胞能有效調(diào)控YAP1可變剪接

培養(yǎng)的SD大鼠心肌細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液漂洗后，置于1 mL 總RNA提示劑中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＜尤?00 μL的三氯甲烷，震蕩器震蕩混勻后冰上，靜置5 min；低溫離心機(jī)中12 000 r/min 離心10 min。小心吸取上清到新的EP管中，加入400 μL異丙醇，上下顛倒，混勻后，置于-20 ℃冰箱，沉淀RNA。超速離心機(jī)12 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄上清，管底可見RNA白色沉淀斑塊。加入75%乙醇1 mL，8000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清。短暫離心，用移液槍將剩余乙醇吸凈，晾干。待酒精徹底揮發(fā)后，RNA沉淀斑塊由白色變?yōu)橥该?，加入無RNA酶的水40 μL，吹打溶解RNA。取1 μL RNA進(jìn)行濃度測定。

3 討論

本研究通過PUF人工剪接因子實(shí)現(xiàn)了YAP1可變剪接的調(diào)控；構(gòu)建了相應(yīng)的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，能夠?qū)π募〖?xì)胞等多種原代細(xì)胞進(jìn)行有效轉(zhuǎn)染，并具有在體內(nèi)應(yīng)用的潛能。

本研究提供了一種操縱YAP1可變剪接的策略，可能為治療YAP1可變剪接異常相關(guān)疾病提供一種技術(shù)手段。以前調(diào)節(jié)疾病相關(guān)剪接的方法都使用反義寡核苷酸掩蓋剪接信號或通過延伸的未配對尾，招募額外因子，需要相對高劑量的寡核苷酸才能有效改變剪接。與反義寡核苷酸方法相比，基于腺病毒表達(dá)系統(tǒng)的人工剪接因子調(diào)控可變剪接更靈活，因?yàn)樗鼈兛梢杂绊懚喾N選擇拼接。

哺乳動物細(xì)胞中存在1500余種RNA結(jié)合蛋白，很多具有剪接調(diào)控功能。大多數(shù)剪接因子通過RRMs或K同源結(jié)構(gòu)域等中等親和力結(jié)合短的RNA元件。因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)合親和力較弱，并且缺乏預(yù)測性RNA識別代碼，所以利用這些結(jié)構(gòu)域設(shè)計RNA識別模塊可行性較低。這些RNA結(jié)合蛋白中，Pumilio1的PUF結(jié)構(gòu)域能與同源RNA序列緊密結(jié)合。本研究將應(yīng)用這種生成具有可預(yù)測特異性的RNA結(jié)合模塊，使用了PUF蛋白的獨(dú)特RNA識別模式，構(gòu)建了調(diào)控YAP1可變剪接的人工剪接因子。既往基于PUF的人工剪接因子已被用來調(diào)控Bcl-x、TEAD4 等多種剪接亞型的轉(zhuǎn)換。理想情況下，這種工程剪接因子（ESF）應(yīng)該識別任何目標(biāo)，并以期望的方式調(diào)節(jié)剪接。但是在實(shí)驗(yàn)操作過程中，由于受結(jié)構(gòu)限制，人工剪接因子通過PUF結(jié)構(gòu)域識別特定區(qū)域，發(fā)揮剪接調(diào)控作用的效果，可能受到空間位阻的限制，因此需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，在本研究中，選擇6條序列來設(shè)計PUF-剪接因子，其中只有一條效果比較明顯。另外，PUF-剪接因子對可變剪接的調(diào)控作用與靶向調(diào)節(jié)的RNA分子自身有關(guān)；有些RNA 分子的可變剪接容易受SR 或Gly 結(jié)構(gòu)域的調(diào)控。那么，這些相應(yīng)的分子的可變剪接也更容易被人工剪接因子控制。

本研究的創(chuàng)新性在于通過腺病毒構(gòu)建了PUF-SR人工剪接因子能夠調(diào)控難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的可變剪接。有研究表明通過PUF結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)展可以RNA結(jié)合蛋白識別的結(jié)合特異性，設(shè)計基于蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合域來識別任意的RNA序列。而這種方法會產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確結(jié)合，但是通過以腺病毒為載體設(shè)計的PUF結(jié)構(gòu)域恰好可以避免這種情況。有研究表明通過PUF結(jié)構(gòu)域設(shè)計出人工RNA結(jié)合蛋白來幫助人們更好的了解RBPS和MiRNAs之間的功能關(guān)系，從而為治愈癌癥等疾病提供方法。設(shè)計人工剪接因子來指導(dǎo)他們自己的前mRNAs的拼接提供了一個獨(dú)特的機(jī)會來構(gòu)建新的拼接調(diào)控反饋回路甚至新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因此可以用來系統(tǒng)地模擬拼接調(diào)控是如何實(shí)現(xiàn)的。目前利用PUF結(jié)構(gòu)域來應(yīng)用于動物細(xì)胞的研究較少，大部分都還是注重于植物或者微生物中，本研究首次通過腺病毒為載體將其應(yīng)用于乳鼠心肌細(xì)胞中并且成功實(shí)現(xiàn)了對YAP1可變剪接的調(diào)控。

本研究對47例老年肺炎患者及20例健康老人的血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平進(jìn)行了檢測和比較，結(jié)果顯示老年肺炎患者血清PCT、hs-CRP及D-Dimer水平明顯高于對照組(P＜0.05)，可能是因?yàn)榘l(fā)生肺炎等肺部疾病時，患者機(jī)體存在的炎癥反應(yīng)會激活機(jī)體應(yīng)急反應(yīng)及凝血系統(tǒng)，最終表現(xiàn)為上述3個指標(biāo)的升高，本研究還發(fā)現(xiàn)高危組老年肺炎患者血清PCT、CRP及D-Dimer水平明顯高于中危及低危2組患者，且其升高水平與肺炎嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，隨著患者病情越重，其濃度越高。

我們在本研究中僅僅是構(gòu)建了PUF-SR人工剪接因子的腺病毒，至于PUF-SR人工剪接因子調(diào)控YAP1可變剪接后是否影響心肌細(xì)胞的病理生理功能，仍有待于進(jìn)一步研究。