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    鹿紅方調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路抑制心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

    2022-07-17 10:25:56趙丹丹瞿惠燕楊濤張曉青郭佳瑩周華
    關(guān)鍵詞:培哚紅方貨號(hào)

    趙丹丹,瞿惠燕,楊濤,張曉青,郭佳瑩,周華

    上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院心病研究所,上海 201203

    心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的終末階段,具有較高的發(fā)病率和病死率,且預(yù)后較差。左心功能與結(jié)構(gòu)改變是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的預(yù)測(cè)指標(biāo),與心肌細(xì)胞的進(jìn)行性丟失密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞進(jìn)行性丟失的主要原因。有研究表明,細(xì)胞凋亡參與心臟由代償性肥大到失代償性重構(gòu)的全過(guò)程。因此,抑制或消除凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能有利于阻止不良重構(gòu)和心力衰竭的進(jìn)展。PI3K/AKT通路是機(jī)體具有多重效應(yīng)的信號(hào)通路,并可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員活性與表達(dá)調(diào)控細(xì)胞凋亡,參與心力衰竭的病理生理過(guò)程。

    研究表明,中醫(yī)藥辨證論治心力衰竭具有多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)的作用。鹿紅方是周華教授治療心力衰竭的有效經(jīng)驗(yàn)方,具有補(bǔ)腎強(qiáng)心、活血通絡(luò)功效,已在臨床應(yīng)用數(shù)十年。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),鹿紅方可以改善心力衰竭患者心功能與臨床癥狀,抑制心力衰竭動(dòng)物模型心肌細(xì)胞焦亡與炎癥反應(yīng),延緩心力衰竭進(jìn)程?;诖?,本研究通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈制備心肌梗死后心力衰竭大鼠模型,觀察鹿紅方能否通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT通路抑制心肌細(xì)胞凋亡,為鹿紅方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物

    SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只,7~8周齡,購(gòu)于浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(浙)2019-0001。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度55%~75%環(huán)境,12 h/12 h明暗交替,自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(PZSHUTCM190322020)。

    1.2 藥物及制備

    鹿紅方(鹿角片15 g,紅花9 g,山萸肉15 g,補(bǔ)骨脂20 g,淫羊藿30 g,女貞子30 g,沉香6 g),飲片購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院。按比例稱取飲片,加10倍量水浸泡45 min,煎煮85 min,過(guò)濾,收集濾液,藥渣再加水煎煮45 min,過(guò)濾,合并2次濾液,減壓濃縮,噴霧干燥,制成干浸膏備用(每克浸膏含原藥材4.08 g),使用前加蒸餾水配制成濃度為0.276 g/mL。培哚普利片,8 mg/片,施維雅(天津)制藥有限公司,批號(hào)190527-02,使用前加適量蒸餾水配制成濃度為0.072 mg/mL。

    1.3 主要試劑與儀器

    TUNEL試劑盒(武漢賽維爾,貨號(hào)G1501),B型利鈉肽(BNP)試劑盒(上海朗頓生物,貨號(hào)BPE30445),異氟烷(上海玉研,貨號(hào)S10010533),BCA蛋白定量試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、SDS-PAGE配制試劑盒、BSA(上海碧云天生物,貨號(hào)分別為P0012、P1045、P0013C、P0012AC、ST023-200g),PI3K 抗體(美國(guó)CST,貨號(hào)4249),Akt抗體(美國(guó)CST,貨號(hào)4691),p-Akt抗體(美國(guó)CST,貨號(hào)4060),Bcl-2 抗體(英國(guó)Abcam,貨號(hào)ab196495),GAPDH 抗體(美國(guó)CST,貨號(hào)5174),Bax 抗體(美國(guó)Proteintech,貨號(hào)50599-2-Ig),HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)CST,貨號(hào)7074)。小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(美國(guó)GE,型號(hào)VIVID5),小動(dòng)物麻醉機(jī)、呼吸機(jī)(上海玉研,型號(hào)分別為ABS-100、SAR-100),動(dòng)物用心電圖機(jī)(深圳邦健,型號(hào)ECG-101G),多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek,型號(hào)Synergy H1),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能,型號(hào)4600SF)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 分組、造模及給藥

    60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、鹿紅方組和培哚普利組,每組15只。除假手術(shù)組外,其余大鼠參照文獻(xiàn)[9]方法通過(guò)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)制備心力衰竭模型。大鼠術(shù)前禁食12 h,異氟烷吸入麻醉,連接呼吸機(jī),于左胸第3、4肋間靠近胸骨處剪開(kāi)皮膚,打開(kāi)胸腔,去除心包膜,在左心耳下緣2 mm處用6-0號(hào)帶針絲線結(jié)扎LAD,結(jié)扎成功可見(jiàn)心尖部變白、心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高。將心臟復(fù)位,關(guān)閉胸腔,逐層進(jìn)行縫合。術(shù)后連續(xù)7 d肌肉注射青霉素(40萬(wàn)U/d)預(yù)防感染。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎,其余操作步驟同前。

    術(shù)后第2日開(kāi)始灌胃,按照人與動(dòng)物體表面積法換算給藥劑量,鹿紅方組給藥劑量為2.76 g/(kg·d),培哚普利組給藥劑量為0.72 mg/(kg·d),灌胃體積1 mL/100 g,假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水,連續(xù)8周。

    2.2 超聲檢測(cè)

    末次給藥結(jié)束后,大鼠異氟烷吸入麻醉,采集M型超聲圖像,檢測(cè)大鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(LVFS)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)和左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs),評(píng)價(jià)大鼠心功能和結(jié)構(gòu)。

    2.3 ELISA檢測(cè)

    BNP由心室肌細(xì)胞分泌,是目前心力衰竭診斷、評(píng)估病情與預(yù)后的常用指標(biāo),與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。超聲檢測(cè)結(jié)束后,行腹主動(dòng)脈穿刺采血,常溫靜置2 h,4 ℃、3 000 r/min離心10 min,分離上清液,按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)大鼠血清BNP含量。

    2.4 HE和Masson染色

    腹主動(dòng)脈取血結(jié)束后,迅速摘取大鼠心臟,用預(yù)冷生理鹽水沖洗,置于4%多聚甲醛中固定24 h以上。常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,分別進(jìn)行HE 染色和Masson染色,觀察心肌組織病理改變和纖維化情況。采用Image J軟件計(jì)算心肌纖維化面積,心肌纖維化面積(%)=膠原面積÷視野總面積×100%。

    2.5 TUNEL檢測(cè)

    取大鼠心肌組織石蠟切片,脫蠟至水,蛋白酶K進(jìn)行抗原修復(fù),破膜,加TUNEL顯色反應(yīng)液,37 ℃孵育2 h,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,每張切片選取3個(gè)不重疊視野,采用Image J軟件計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

    2.6 Western blot檢測(cè)

    取50 mg心肌組織,加入裂解液裂解,BCA法測(cè)定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%BSA 室溫封閉2 h,TBST 洗膜7 min×3 次,滴加PI3K 一抗(1∶1 000)、AKT 一抗(1∶1 000)、p-AKT一抗(1∶2 000)、Bcl-2一抗(1∶1 000)、Bax一抗(1∶5 000)、GAPDH一抗(1∶2 000),4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。TBST 洗膜7 min×3 次,滴加相應(yīng)二抗(1∶3 000),常溫孵育2 h。TBST 洗膜7 min×3 次,滴加ECL 發(fā)光液,化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取圖像,以GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件計(jì)算各條帶灰度值。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    4 結(jié)果

    4.1 鹿紅方對(duì)模型大鼠心功能的影響

    與假手術(shù)組比較,模型組大鼠LVEF、LVFS明顯降低(<0.01),LVIDd、LVIDs 明顯升高(<0.01),提示長(zhǎng)期容量負(fù)荷超載導(dǎo)致大鼠左心功能降低,心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,心力衰竭模型復(fù)制成功。與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高(<0.01),LVIDd、LVIDs 明顯降低(<0.01);與鹿紅方組比較,培哚普利組大鼠LVEF、LVFS明顯升高(<0.05),LVIDd、LVIDs差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較()

    4.2 鹿紅方對(duì)模型大鼠血清B型利鈉肽含量的影響

    與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清BNP含量明顯增加(<0.01);與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠血清BNP含量明顯減少(<0.01);鹿紅方組與培哚普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠血清BNP含量比較(,ng/L)

    4.3 鹿紅方對(duì)模型大鼠心肌組織病理變化的影響

    HE染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排序有序,形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核致密清晰;模型組大鼠心肌組織有不同程度變性、壞死,心肌細(xì)胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)模糊,局部心肌細(xì)胞消失,被增生的結(jié)締組織取代,有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織病理?yè)p傷均明顯改善,心肌細(xì)胞水腫、壞死明顯減輕,排列略不規(guī)則,有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

    圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)(HE染色,bar=200 μm)

    4.4 鹿紅方對(duì)模型大鼠心肌纖維化的影響

    Masson染色中正常大鼠心肌組織呈紅色,膠原纖維呈藍(lán)色。結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠心肌組織僅在血管周圍有少量散在的膠原纖維沉積;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠膠原纖維沉積嚴(yán)重,心肌纖維化面積明顯增加(<0.01);與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織膠原纖維沉積明顯減輕,心肌纖維化面積明顯減少(<0.05);鹿紅方組與培哚普利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。

    表3 各組大鼠心肌纖維化面積比較(,%)

    圖2 各組大鼠心肌組織形態(tài)(Masson染色,bar=3 mm)

    4.5 鹿紅方對(duì)模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

    TUNEL染色中陽(yáng)性凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光。結(jié)果顯示,假手術(shù)組大鼠僅有少量心肌細(xì)胞凋亡;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(<0.01);與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(<0.01);鹿紅方組與培哚普利組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。結(jié)果見(jiàn)圖3、表4。

    圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)(TUNEL染色,bar=20 μm)

    表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較(,%)

    4.6 鹿紅方對(duì)模型大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達(dá)明顯升高(<0.01,<0.05),Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低(<0.01);與模型組比較,鹿紅方組和培哚普利組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bax 蛋白表達(dá)明顯降低(<0.01,<0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(<0.01);鹿紅方組與培哚普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。見(jiàn)圖4、表5。

    圖4 各組大鼠心肌組織PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白免疫印跡

    表5 各組大鼠心肌組織PI3K、p-AKT、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較()

    5 討論

    心力衰竭發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及病理因素眾多。目前認(rèn)為,心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的基本機(jī)制,心肌細(xì)胞凋亡是心室重構(gòu)的重要病理基礎(chǔ)。正常情況下,細(xì)胞凋亡一般在衰老的細(xì)胞中發(fā)生,是機(jī)體維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的自我保護(hù)機(jī)制。當(dāng)受到缺血、缺氧等損傷刺激時(shí),機(jī)體氧化應(yīng)激水平增加、炎癥因子增多、細(xì)胞膜完整性及穩(wěn)定性被破壞,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡可使心肌細(xì)胞數(shù)量驟減,心臟收縮與舒張功能失常,最終導(dǎo)致心腔擴(kuò)大、心室壁變薄、心肌肥大等心肌重構(gòu)的病理表現(xiàn)。因此,有效抑制心肌細(xì)胞凋亡對(duì)心力衰竭的防治和預(yù)后具有積極意義。

    PI3K/AKT信號(hào)通路具有多種效應(yīng)功能,在調(diào)節(jié)血管再生、內(nèi)皮細(xì)胞功能、心肌細(xì)胞凋亡及糖脂代謝中具有重要作用,其對(duì)凋亡的調(diào)控主要體現(xiàn)在直接或間接調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用,Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平與凋亡調(diào)控直接相關(guān)。PI3K是由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85)兩部分構(gòu)成的二聚體蛋白,當(dāng)接收到刺激信號(hào)時(shí),機(jī)體可通過(guò)2條途徑將底物二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿崃字<〈迹≒IP3)而活化,活化后的PIP3進(jìn)一步與AKT結(jié)合,使AKT募集到膜上而磷酸化激活。AKT磷酸化(p-AKT)水平是PI3K/AKT信號(hào)通路活化的重要標(biāo)志之一。研究表明,長(zhǎng)期心力衰竭患者心肌組織p-AKT水平顯著升高,經(jīng)左室輔助裝置治療后心肌組織p-AKT水平下降,心肌肥厚減輕,心功能得到改善。研究發(fā)現(xiàn),心力衰竭模型小鼠p-AKT水平明顯升高,可誘導(dǎo)Bax表達(dá),促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,而抑制p-AKT表達(dá)可有效改善模型小鼠心功能,減少心肌細(xì)胞凋亡,減輕心肌肥厚。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,心力衰竭為本虛標(biāo)實(shí)之證,本虛以心氣虛、心陽(yáng)虛為主,標(biāo)實(shí)以水飲、瘀血、痰濁為患。由于“心腎相交”“水火既濟(jì)”,心陽(yáng)虛不能下歸于腎,導(dǎo)致腎陽(yáng)漸虛,腎陽(yáng)虛衰又無(wú)以溫煦心陽(yáng),終致心腎陽(yáng)虛。腎陽(yáng)為一身陽(yáng)氣之本,“五臟之陽(yáng)氣非此不能發(fā)”。因此,心力衰竭中醫(yī)治療強(qiáng)調(diào)“心腎同治”,鹿紅方正是在此理論基礎(chǔ)上創(chuàng)制而成。方中鹿角片溫陽(yáng)補(bǔ)腎、行血消腫,紅花活血袪瘀通經(jīng),二者共為君藥;補(bǔ)骨脂、淫羊藿助君藥溫腎助陽(yáng)之力,二者皆為臣藥;山萸肉、女貞子補(bǔ)益肝腎之陰陽(yáng),沉香溫腎納氣平喘,三藥合用調(diào)補(bǔ)陰陽(yáng),共為佐使藥。諸藥合用,共奏溫腎強(qiáng)心、活血通絡(luò)功效。

    本實(shí)驗(yàn)以LAD結(jié)扎法制備心力衰竭大鼠模型,以鹿紅方干預(yù),發(fā)現(xiàn)鹿紅方可有效提高模型大鼠心功能,降低血清BNP含量,減輕心肌纖維化,抑制心肌細(xì)胞凋亡,并且下調(diào)PI3K、p-AKT、Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),提示其抗凋亡機(jī)制與抑制PI3K/AKT/Bax信號(hào)通路活化有一定關(guān)系。本研究揭示了鹿紅方抑制心肌細(xì)胞凋亡的可能作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用和深入研究提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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