基于指紋圖譜與多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)的彝族藥紫地榆質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

田宇柔，郗仲玟，馮玉，姜曉婭，牛麗穎

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091；2.河北省中藥配方顆粒技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050091；3.中藥材品質(zhì)評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)化河北省工程研究中心，河北 石家莊 050091；4.河北省高校中藥配方顆粒應(yīng)用技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050091

紫地榆，又名赤地榆、隔山消，為牻牛兒苗科紫地榆Knuth的干燥根，始載于《滇南本草》，為云南省特有民族藥，收載于2005年版《云南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)（第一冊(cè)）》，其味苦、酸、澀，性微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫地榆主要含有鞣質(zhì)、酚酸類、黃酮類等化學(xué)成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、止血、防齲、抗氧化等藥理作用?，F(xiàn)行地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其炮制、性狀等鑒定部分進(jìn)行了相關(guān)規(guī)定，但缺乏化學(xué)成分質(zhì)量分析控制，且現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)紫地榆質(zhì)量研究不足，僅對(duì)部分化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，難以對(duì)不同產(chǎn)地藥材的差異性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

近年來，指紋圖譜與多成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制模式廣泛用于中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)，化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)在基源鑒別、炮制研究、真?zhèn)舞b定、產(chǎn)地分析等方面發(fā)揮著重要作用，常用方法包括聚類分析、主成分分析、判別分析、偏最小二乘判別分析（PLSDA）等。在進(jìn)行中藥指紋圖譜的建立與多成分定量的同時(shí)，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)對(duì)數(shù)據(jù)圖譜信息進(jìn)行分析處理，能夠更加科學(xué)客觀地對(duì)中藥質(zhì)量進(jìn)行分析評(píng)價(jià)與控制。因此，本研究建立彝族藥紫地榆HPLC指紋圖譜，同時(shí)對(duì)6種指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，通過SIMCA14.1軟件進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別，以期對(duì)不同產(chǎn)地的紫地榆藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為其質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；CPA225D型電子天平、BSA224S-CW型電子天平，賽多利斯有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

對(duì)照品沒食子酸（批號(hào)110831-201605，純度90.8%）、鞣花酸（批號(hào)111959-201903，純度88.8%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；兒茶素（批號(hào)PS020094）、短葉蘇木酚酸（批號(hào)PS21054-10）、五沒食子酰基葡萄糖（批號(hào)PS020247），純度均為98.0%，成都普思生物科技股份有限公司；柯里拉京（批號(hào)111623-200302），中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher化學(xué)試劑公司，其他試劑均為分析純，水為超純水。

15批紫地榆藥材由神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)楚雄彝族自治州中醫(yī)醫(yī)院副主任醫(yī)師余惠祥鑒定為牻牛兒科紫地榆Knuth的干燥根，來源信息見表1。

表1 15批紫地榆樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱取沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟菍?duì)照品適量，加甲醇溶解，制成一定濃度的對(duì)照品貯備液；精密吸取上述各對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋，即得濃度為沒食子酸48.40 μg/mL、兒茶素135.00 μg/mL、短葉蘇木酚酸14.60 μg/mL、柯里拉京128.40 μg/mL、鞣花酸65.20 μg/mL、五沒食子?；咸烟?40.90 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取紫地榆藥材粉末（過40目篩）約0.2 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（250 W，40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Thermo Syncronis C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，5%～10%A；5～18 min，10%～12%A；18～35 min，12%～13%A；35～37 min，13%A；37～47 min，13%～15%A；47～57 min，15%～16%A；57～67 min，16%～18%A；67～71 min，18%A；71～75 min，18%～20%A；75～80 min，20%A；80～85 min，20%～80%A；85～88 min，0%～5%A；88～95 min，5%A），流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270nm，進(jìn)樣量10μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號(hào)峰）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、5、10、14、20、24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（S1）粉末0.2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以鞣花酸（19號(hào)峰）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 共有峰標(biāo)定取15批紫地榆藥材，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，得15批樣品HPLC色譜圖。將所得色譜圖導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），S1號(hào)色譜圖作為參照?qǐng)D譜，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正進(jìn)行峰匹配，生成疊加圖譜（見圖1）和對(duì)照?qǐng)D譜（見圖2），將分離度較好且為主要成分的色譜峰作為共有峰，最終標(biāo)定21個(gè)共有峰。其中19號(hào)峰的分離度較好且出峰時(shí)間穩(wěn)定，故設(shè)為參照峰（S）。

圖1 15批紫地榆樣品HPLC指紋圖譜

圖2 紫地榆HPLC對(duì)照?qǐng)D譜

2.4.2 相似度評(píng)價(jià)

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版）計(jì)算相似度，15批樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度分別 為0.974、0.982、0.990、0.975、0.989、0.989、0.951、0.908、0.911、0.984、0.984、0.980、0.984、0.985、0.984，均大于0.9，表明不同產(chǎn)地不同批次間紫地榆藥材差異性較小，具有良好的一致性。但由于不同產(chǎn)地環(huán)境等因素的影響，化學(xué)質(zhì)量仍存在一定差異。

采用對(duì)照品對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到對(duì)照品HPLC色譜圖（見圖3）。最終指認(rèn)6個(gè)特征峰，即2、5、7、10、19、21號(hào)峰分別為沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟?。

圖3 紫地榆中6種成分混合對(duì)照品溶液HPLC圖

2.5 化學(xué)成分含量測(cè)定

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、12、16、20 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量為橫色標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及線性范圍（見表2），結(jié)果表明6種化學(xué)成分在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 6種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟堑姆迕娣eRSD 分別為0.49%、0.48%、0.44%、0.49%、0.48%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別在0、5、10、14、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟堑姆迕娣eRSD 分別為0.29%、2.93%、2.95%、1.67%、1.13%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

從公式看出所以在氣體質(zhì)量流量Gg和霧化氣流流速Vg中，提高霧化氣流流速Vg對(duì)氣體動(dòng)能增加效果明顯。從能量守恒定律可推出，氣體的動(dòng)能增加，相應(yīng)轉(zhuǎn)化為增大總表面積的表面能。但是這種能量交換過程效率極低，不到1%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（S3）粉末0.2 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的峰面積RSD分別為0.37%、0.49%、1.06%、2.04%、2.51%、2.93%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（S3）粉末9 份，每份約0.1 g，精密稱定，按各成分含量的50%、100%、150%精密加入已知濃度的對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟瞧骄訕踊厥章史謩e為98.70 %、102.72%、101.31%、102.10%、102.65%、100.12%，RSD分別為1.90%、1.78%、1.50%、1.65%、1.81%、0.54%，表明該方法準(zhǔn)確良好。

2.5.6 含量測(cè)定

取15批紫地榆藥材粉末，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行2份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟呛浚Y(jié)果見表3。

表3 15批紫地榆中6種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）

2.6 化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 主成分分析

為進(jìn)一步探究不同產(chǎn)地批次間紫地榆藥材的質(zhì)量差異性，將15批樣品中沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖的含量作為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行主成分分析，得分圖見圖4。提取特征值＞1的2個(gè)成分作為主成分1、主成分2，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)89.62%（見表4），說明這2個(gè)主成分可反映紫地榆藥材的整體綜合質(zhì)量。

表4 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖4 15批紫地榆PCA得分

主成分載荷矩陣可反映各變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)大小和作用方向，根據(jù)因子載荷矩陣（見表5），主成分1與沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、鞣花酸的含量均呈正相關(guān)，主成分2與兒茶素、短葉蘇木酚酸和五沒食子酰基葡萄糖的含量呈正相關(guān)。根據(jù)各主成分值及貢獻(xiàn)率計(jì)算綜合得分（F），F(xiàn)＝0.514 3F1＋0.381 9F2結(jié)果見表6。綜合得分排序可反映不同批次紫地榆藥材質(zhì)量，排名越高質(zhì)量越好?？梢钥闯觯琒12～S14質(zhì)量相對(duì)較優(yōu)。

表5 因子載荷矩陣

表6 主成分值及綜合主成分值

2.6.2 聚類分析

在SIMCA14.1軟件中以6種活性成分的含量為變量，進(jìn)行系統(tǒng)聚類，結(jié)果見圖5。類間距離為30時(shí)，15批藥材可聚為三類：Ⅰ類S1～S6（產(chǎn)地楚雄雙柏、楚雄姚安）、Ⅱ類S7～S9（產(chǎn)地麗江寧蒗）、Ⅲ類S10～S15（產(chǎn)地麗江華坪、香格里拉維西）。該結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。表明同一產(chǎn)地不同批次藥材間具有較強(qiáng)相似性，不同產(chǎn)地間則差異較大，分析可能與地理位置、氣候等相關(guān)。

圖5 15批紫地榆聚類分析樹狀圖

2.6.3 偏最小二乘判別分析

在主成分分析、聚類分析基礎(chǔ)上，將6種成分含量作為變量導(dǎo)入SIMCA14.1軟件進(jìn)行PLS-DA建模分析，結(jié)果見圖6。PLS-DA 模型累計(jì)解釋模型參數(shù)RX、RY 分別為0.994、0.753，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q為0.511，均大于0.5，表明該模型預(yù)測(cè)能力較好，可用于不同產(chǎn)地紫地榆的區(qū)分分析。

圖6 15批紫地榆PLS-DA得分

變量重要性投影（VIP）可衡量各共有峰的表達(dá)模式對(duì)樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，對(duì)于輔助篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物有較大貢獻(xiàn)。本研究在95%置信區(qū)間內(nèi)優(yōu)先選擇VIP＞1.0的成分作為造成不同批次間質(zhì)量差異的標(biāo)志性化合物，分別為鞣花酸（VIP＝1.20）、兒茶素（VIP＝1.14）、五沒食子?；咸烟牵╒IP＝1.03）、柯里拉京（VIP＝1.00），這些成分可能是造成不同產(chǎn)區(qū)紫地榆質(zhì)量差異的重要因素，結(jié)果詳見圖7。

圖7 紫地榆樣品中6種指標(biāo)成分VIP

3 討論

紫地榆所含化學(xué)成分復(fù)雜，本試驗(yàn)將供試品溶液在190～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，比較不同波長(zhǎng)的色譜峰數(shù)目、峰面積及分離度，發(fā)現(xiàn)在270 nm波長(zhǎng)處各色譜峰峰形較好，分離度高，特征性強(qiáng)。本試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相系統(tǒng)（乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.05%甲酸、乙腈-0.1%磷酸）及比例，結(jié)果顯示以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，所得各色譜峰峰形較好，分離度高。本試驗(yàn)以指標(biāo)成分含量為考察指標(biāo)，對(duì)提取溶劑（甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇）、提取體積（15、25、50 mL）和超聲時(shí)間（15、30、45 min）進(jìn)行單因素考察，發(fā)現(xiàn)以70%甲醇25 mL為溶媒超聲處理30 min時(shí)各成分提取率最高。本試驗(yàn)對(duì)確定的色譜條件進(jìn)行了耐用性研究（不同溫度、波長(zhǎng)、流速、色譜柱），結(jié)果均符合要求，表明此方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為紫地榆的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考。

中藥化學(xué)成分具有多樣性與復(fù)雜性的特點(diǎn)，且各成分之間具有相互協(xié)同作用。多成分的復(fù)雜性決定了單一成分指標(biāo)評(píng)價(jià)難以表達(dá)中藥的質(zhì)量，并由此提出多成分質(zhì)量控制的模式，應(yīng)用最為廣泛有兩類，一類是反映中藥化學(xué)成分整體模糊信息的指紋圖譜方法，另一類是多指標(biāo)成分同時(shí)測(cè)定。本研究采用HPLC對(duì)15批紫地榆藥材進(jìn)行指紋圖譜研究，結(jié)果顯示15批樣品具有良好的相似性，但由于不同產(chǎn)地環(huán)境等因素的影響，化學(xué)質(zhì)量仍存在一定差異，故選擇沒食子酸、兒茶素、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子酰基葡萄糖6種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，所選擇的6種成分均有一定的藥理活性作用。沒食子酸、兒茶素、柯里拉京、鞣花酸、五沒食子?；咸烟蔷鶠樽系赜苤绪焚|(zhì)類化合物，鞣質(zhì)為紫地榆的有效化學(xué)成分，具有抗氧化、防齲、抗菌、抗病毒作用，其中沒食子酸、兒茶素和鞣花酸具有較強(qiáng)的抑菌活性，可對(duì)致齲菌產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制、加快衰亡、降低黏附、破壞細(xì)胞膜、改變通透性、破壞生物膜完整，以及降低乳酸脫氫酶、蔗糖酶活性的作用。短葉蘇木酚酸為酚酸類化合物，羅廷順等在優(yōu)化紫地榆多酚提取工藝的基礎(chǔ)上，考察其體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)紫地榆多酚清除DPPH和ABTS的能力良好，尤其對(duì)ABTS清除能力最優(yōu)并呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。含量測(cè)定結(jié)果顯示，5種鞣質(zhì)類指標(biāo)成分含量均大于短葉蘇木酚酸，短葉蘇木酚酸含量較低且不同產(chǎn)地樣品間各成分含量存在較大差異。

為進(jìn)一步考察不同產(chǎn)地藥材差異，采用主成分分析、聚類分析及PLS-DA方法對(duì)紫地榆進(jìn)行綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示S12～S14產(chǎn)地的紫地榆藥材質(zhì)量較優(yōu)，結(jié)合含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較優(yōu)產(chǎn)地藥材其6種活性成分含量也較高。通過VIP排序，篩選得到影響紫地榆藥材質(zhì)量的4種標(biāo)志性成分，分別為鞣花酸、兒茶素、五沒食子?；咸烟恰⒖吕锢?。本研究所建立的HPLC指紋圖譜及多成分含量測(cè)定方法穩(wěn)定可靠，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可更加全面綜合地對(duì)紫地榆藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。但由于紫地榆中所發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分較少，是否存在影響其質(zhì)量的其他成分尚待確認(rèn)。后續(xù)研究將運(yùn)用多種分析技術(shù)對(duì)紫地榆進(jìn)行全面的化學(xué)成分分析，補(bǔ)充化學(xué)成分信息庫(kù)，以期建立更加科學(xué)可靠的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。