關(guān)于廣西麻雞肌肉組織中表達(dá)差異基因篩選

陳 婷，盧晟盛，楊麗麗，李添寶，張 敏，江明生通信作者

(1.廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西 南寧 530004;2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西 南寧 530004)

0 引言

廣西麻雞是廣西優(yōu)秀地方品種，是經(jīng)過不斷選育而成的一種優(yōu)質(zhì)型肉雞，有體型適中、耐粗飼、生活力強(qiáng)和肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，是研究廣西地方雞種較好的素材[1]。在廣西地方品種雞中，廣西麻雞的活重、屠體重、半凈膛重和全凈膛重優(yōu)于三黃雞和東蘭烏雞[2]。RNA-seq 是轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析技術(shù)，并且廣泛應(yīng)用于畜禽性狀標(biāo)記基因的挖掘和育種。關(guān)于對雞的轉(zhuǎn)錄組研究中，已有相關(guān)學(xué)者研究黃山黑雞[3]、臧雞[4]、靜原雞[5]和靜海黃雞[6]等肌肉轉(zhuǎn)錄組，但對廣西麻雞胸肌和腿肌的轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究尚未報道。

本研究通過 RNA-Seq技術(shù)對廣西麻雞胸肌和腿肌組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對差異表達(dá)基因篩選與功能注釋，分析其轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，尋找差異表達(dá)基因及信號通路，為下一步廣西麻雞的品種改良提供參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗雞群廣西南寧良慶區(qū)農(nóng)利來種禽有限公司飼養(yǎng)，120日齡屠宰，采集3只，頸動脈放血，采集胸肌和腿肌組織，投入液氮中后，放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

用TRIzol試劑盒提取RNA，經(jīng)檢測，濃度>50 ng/μL，RIN值>7.0，OD260/280>1.8，total RNA>1 μg滿足后續(xù)實驗。

1.3 文庫構(gòu)建和illumina測序

樣本RNA經(jīng)過質(zhì)量檢測合格后，形成片段大小為300±50 bp的文庫，使用illumina NovaseqTM6 000測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控及基因組對比

用Cutadapt過濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)，使用Hisat2對預(yù)處理后的有效數(shù)據(jù)(Valid Data)進(jìn)行參考基因組比對。

1.5 差異表達(dá)基因篩選

用R包DESeq2對樣本之間進(jìn)行差異表達(dá)分析，差異基因通過篩選閾值|log2FC|≥2且錯誤發(fā)現(xiàn)率≤0.05，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。

1.6 差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

為了進(jìn)一步分析肌肉組織中基因的功能，將篩選出的基因進(jìn)行GO(http://www.geneontology.org/)富集分析和用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫篩選基因顯著富集的GO和KEGG通路。

1.7 關(guān)于生長性狀候選基因的篩選

主要對GO和KEGG通路差異性(P<0.05)信息進(jìn)行表達(dá)差異基因的篩選，可以獲取肌肉組織中差異表達(dá)基因的信息，通過文獻(xiàn)綜述，然后對PubMed檢索和對根據(jù)測序結(jié)果篩選候選基因。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控及基因組比對統(tǒng)計

在本試驗中，從數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果上得出廣西麻雞胸肌、腿肌樣本的數(shù)據(jù)量都在46 670 002～50 736 226Total reads 范圍內(nèi)；Q20的含量均在99.90%以上，Q30的含量均在 97.36%以上；所有樣品中G+C含量集中分布在49.50%～50.50%，測序質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計如表1所示。綜上所述，測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較好，滿足后續(xù)試驗要求。

表1 測序質(zhì)量數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

對120日齡廣西麻雞胸肌和腿肌的轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)1 953個表達(dá)差異基因，其中上調(diào)基因1 415個，下調(diào)基因538個，表達(dá)差異基因的火山圖如圖1所示。

圖1 廣西麻雞肌肉組織表達(dá)差異基因的火山圖

2.3 GO功能富集分析

GO條目分別描述了基因的分子功能(molecular function，mf)、細(xì)胞組分(cellular component，cc)、參與的生物學(xué)過程(biological process，bp)。對轉(zhuǎn)錄組文本中GO富集的條目統(tǒng)計，GO條目有754個，廣西麻雞肌肉組織大部分條目聚集在生物過程中。

2.4 KEGG富集分析

富集分析以P<0.05為條件，有34個KEGG富集通路，對前20個通路繪制的氣泡圖如圖2所示，氣泡越大表示富集的基因越多，經(jīng)對文獻(xiàn)查找和其他研究者對比發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路、粘著斑、PPAR信號通路和心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號可能是參與整個生長發(fā)育時期的重要通路。

圖2 KEGG富集分析氣泡圖

2.5 關(guān)鍵候選差異基因的篩選

對比120日齡基轉(zhuǎn)錄文本中因基因表達(dá)譜，在顯著富集GO條目及KEGG通路上差異基因和PubMed的查找，發(fā)現(xiàn)FHL、RBP7、MYBPC1、MUSTN1、GPAM、TGF-β 3、MY01C、IGF2和ADAM12差異極顯著(P<0.05)，能作為廣西麻雞生長性狀的候選基因，進(jìn)一步研究需要功能驗證確定其調(diào)控機(jī)制。

3 結(jié)論

通過RNA-Seq技術(shù)對廣西麻雞胸肌和腿肌組織中差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，120日齡肌肉組織中有1 953個表達(dá)差異基因，其中上調(diào)基因1 415個，下調(diào)基因538個。MAPK信號通路、粘著斑、PPAR信號通路和心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號通路等，F(xiàn)HL、RBP7、MYBPC1、MUSTN1、TGF-β 3、MY01C、IGF2和ADAM12可能是對肌肉發(fā)育的重要信號通路和候選基因。