生物催化惰性碳?xì)滏I的氘代反應(yīng)研究進展

樓玉姣，徐鑒，吳起

（1 浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310027； 2 浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

隨著2017 年第1 個氘代藥物丁苯那嗪通過美國FDA 批準(zhǔn)上市，并于2020 年5 月在中國批準(zhǔn)上市，氘代藥物便逐漸進入人們的視野，并不斷為眾多國家和醫(yī)療機構(gòu)所認(rèn)可［1］。丁苯那嗪是一種非典型抗精神病藥物，臨床上主要用于治療運動障礙、精神病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙相關(guān)的疾病，但該藥物存在患者依存性低、半衰期短等缺陷。而經(jīng)過氘化處理，將其苯環(huán)上的兩個甲氧基的氫原子置換成氘原子，可以顯著降低其代謝速度，延長半衰期，從而減少給藥量，同時還能夠抑制因藥物引起的血液濃度下降而產(chǎn)生的戒斷反應(yīng)［2-3］。因此，氘代技術(shù)被認(rèn)為是一種可應(yīng)用于改進臨床試驗或已上市的不理想藥物的重要手段。截至2020 年，全球已有10 余個氘代藥物進入臨床試驗階段，數(shù)百個氘代藥物相關(guān)專利申請已獲得包括美國、中國在內(nèi)的國家知識產(chǎn)權(quán)局的授權(quán)。

由于氘代化合物的優(yōu)越特性，氘代分子也被廣泛應(yīng)用在科學(xué)研究領(lǐng)域。氘標(biāo)記的化合物可以作為帶有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的目標(biāo)分子，成為液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析的內(nèi)標(biāo)［5］。例如，氘代氨基酸已被用作核磁共振（NMR）、氫氘交換質(zhì)譜（HDXMS）、X 射線晶體學(xué)和拉曼散射顯微鏡的蛋白質(zhì)標(biāo)簽。此外，由于上述多種原因，氘代化合物在保持原藥效力的同時，在人體內(nèi)有更長的代謝周期和更少的毒性代謝物生成，所以可以應(yīng)用于臨床試驗跟蹤，為評估藥物毒性提供極大幫助。另外，由于磁性和質(zhì)量的不同，氘代分子與原分子被核磁共振或質(zhì)譜檢測分析為兩個不同的實體，成為了研究和證實化學(xué)反應(yīng)機理和動力學(xué)的重要工具。

由于氘代分子在化學(xué)、醫(yī)藥和生物科學(xué)中的重要性，制定不同的方案在有機分子中插入氘越來越受到大家的重視。到目前為止，已經(jīng)報道過多種能夠?qū)崿F(xiàn)在分子中插入氘原子的反應(yīng)方法，包括酸堿直接促進的氫氘交換［6-9］、金屬催化［10-16］，以及逐漸興起的電化學(xué)催化［17-20］和光催化方法［21-26］?；瘜W(xué)催化劑的發(fā)展極大提高了氘代的區(qū)域選擇性［27-29］。但是在對映體選擇性合成方面還有待提高［30-31］，而且化學(xué)催化劑通常需要較為嚴(yán)苛的反應(yīng)條件。例如在醛氘代反應(yīng)中經(jīng)常需要使用到具有復(fù)雜配體結(jié)構(gòu)的銥催化劑和氘氣，而且芳香環(huán)氘標(biāo)記和醛羰基的氘標(biāo)記是競爭性反應(yīng)，很容易得到混合物［32-33］。因此近年來，探索更為高效、綠色、高選擇性的氘代策略是一個具有重要科學(xué)意義和和應(yīng)用價值的課題。

生物酶催化因其具有反應(yīng)高效、條件溫和、過程綠色等優(yōu)點，在合成領(lǐng)域逐漸受到重視。酶具有近乎完美的立體選擇性，生物催化在不對稱合成領(lǐng)域的興起極大拓展了不對稱合成的途徑［34-39］。近年來，酶催化多功能性的研究獲得了突破性的進展，越來越多的酶催化非天然反應(yīng)被發(fā)現(xiàn)［38-48］，而在生物催化有機分子中引入氘元素的合成方法研究中也取得較多進展，研究人員利用天然來源或人工改造的酶，以重水作為氘源成功在一些有機分子的惰性碳?xì)滏I上引入氘原子。目前，通過生物催化的氘代合成方法主要分為氫氘交換、還原氘代、脫羧氘代三大類。本文將從以上3個方面對酶催化氘代領(lǐng)域的最新進展進行綜述。

1 氫氘交換

直接通過催化劑活化，并用氘元素取代有機小分子中的非活潑氫原子是氘代反應(yīng)中最有價值的策略，具有極高的原子經(jīng)濟性［49］。在化學(xué)催化領(lǐng)域，已有眾多酸堿催化［50-52］、金屬催化［53-55］的不活潑C－H 發(fā)生氫氘交換反應(yīng)的研究，然而這一方法在生物催化領(lǐng)域依然處于起步階段。

色氨酸酶（tryptophanase，TPase）是一類以磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）為輔酶的生物酶［56］，該酶的天然反應(yīng)是催化微生物體內(nèi)色氨酸的厭氧分解，生成吲哚、丙酮酸和氨氣［57-59］。之前的研究表明，該酶可以催化吲哚與S-甲基-L-半胱氨酸的縮合反應(yīng)生成色氨酸［60］，于是Boroda等［61］在重水或氚水的體系中實現(xiàn)了α位的同位素標(biāo)記（圖1）。另外，Kawata課題組［62］發(fā)現(xiàn)這種酶會導(dǎo)致L-酪氨酸的α位置碳上的氫不穩(wěn)定，可以與重水或者氚水發(fā)生H/D（T）交換生成標(biāo)記產(chǎn)物。后續(xù)串聯(lián)酪氨酸酶（tyrosinase）還可以發(fā)生進一步的羥基化（圖2）［63-64］。

圖1 吲哚與S-甲基-L-半胱氨酸合成L-TrpFig.1 Synthesis of L-Trp with indole and(S)-methyl-L-cysteine

圖2 酪氨酸α位的氫氘交換Fig.2 Hydrogen deuterium exchange at the α-carbon position of tyrosine

2017 年，Rabinowitz 課題組［65］報道了一個黃素酶引發(fā)的NADPH 與黃素的氫氘交換反應(yīng)（圖3）。當(dāng)NADPH 與D2O 共存時，氧化還原性H位置并未發(fā)生氫氘交換現(xiàn)象，但是當(dāng)向體系中加入一種常見的黃素酶——谷胱甘肽還原酶后，NADPH 約在1 min 內(nèi)被氘代。因此可以推斷，NADPH 的氧化還原活性氫并不會發(fā)生自發(fā)的H-D交換，而是在黃素酶催化下發(fā)生的［66-68］。研究者嘗試了其他NADPH 依賴的黃素酶［69-72］，它們同樣催化了NADPH 的H-D 交換反應(yīng)。他們將8 種不同的人類細(xì)胞放置在含有D2O的介質(zhì)中，并在細(xì)胞中尋找到了被氘標(biāo)記的NADPH，證明了這一現(xiàn)象的普遍性。最后，通過氘代的NADPH 參與的細(xì)胞內(nèi)循環(huán)成功將氘元素引入了脂肪酸中。

圖3 黃素酶引發(fā)的NADPH氫氘交換反應(yīng)Fig.3 Hydrogen deuterium exchange catalyzed by FAD-dependent enzyme

2020年，Narayan課題組［73］利用PLP依賴型的α-氧胺合成酶（SxtAAONS），采用D2O作為氘源制備一系列的α-D-氨基酸和酯（圖4），氘代產(chǎn)物具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性。傳統(tǒng)的化學(xué)方法可以從保護的甘氨酸衍生物或者沒有標(biāo)記的氨基酸起始來合成α-氘代氨基酸，前者需要氨基保護和去保護等多個步驟，而后者則需要含有手性配體的貴金屬銠或當(dāng)量鎳催化劑［圖4（a）］［74-76］。相對而言，α-氧胺合成酶催化合成α-氘代氨基酸的方法則具有多方面的優(yōu)勢：①精準(zhǔn)的立體選擇性；②不需要保護基團；③更加綠色、溫和的反應(yīng)條件。α-氧胺合成酶活性中心的磷酸吡哆醛（PLP）可以通過形成外部醛亞胺中間體可逆地催化α-氨基酸的去質(zhì)子化。相應(yīng)形成的醌式中間體可以在產(chǎn)物從活性位點釋放前被重水或者氘代的賴氨酸所氘代，從而實現(xiàn)α-氘代氨基酸的生成［圖4（b）］。最后，作者證明了這種操作簡單的反應(yīng)在制備規(guī)模上的價值，以200 mg L-Ala-OMe 為起點，通過3 個步驟，以60%的產(chǎn)率，大于99%的氘摻入率和96%的ee獲得氘化L-Ala-OMe，以96%的最終氘代率合成了藥物Safinamide——一種用于治療帕金森病的藥物。

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圖4 氨基酸及其甲酯的α位氘代反應(yīng)Fig.4 Deuterium incorporation at the α-carbon of amino acids and their methyl esters

最近，我們報道了焦磷酸硫胺素（ThDP）依賴性酶催化的氫氘交換反應(yīng)合成氘代醛的工作［77］。ThDP 輔因子包含N-雜環(huán)卡賓（NHC）核心，它能夠通過生成Breslow 中間體來激活醛的C－H 鍵，通過該中間體，ThDP 依賴性酶能夠催化廣泛的C－C 鍵形成和裂解反應(yīng)。我們認(rèn)為從機制上講形成的Breslow 中間體可以在D2O 存在下進行氫同位素交換（HIE），將醛轉(zhuǎn)化為其氘代類似物。然而，在相同條件下，C－C 鍵形成反應(yīng)（例如：安息香縮合反應(yīng)）在動力學(xué)上也是有利的，與醛的氘代相比，在大多數(shù)ThDP 依賴性酶的特異性結(jié)合口袋中更容易發(fā)生安息香縮合等天然反應(yīng)。因此，如何實現(xiàn)醛通過Breslow 中間體的氘代反應(yīng)同時阻斷C－C 鍵形成，是一項挑戰(zhàn)，我們通過對ThDP 依賴性酶的催化空腔進行理性設(shè)計，讓不同大小的催化空腔能適應(yīng)不同醛底物的大小，避免兩個醛底物同時進入催化空腔生成競爭性的安息香縮合反應(yīng)產(chǎn)物，從而構(gòu)建了一個具有較廣泛適用性的生物催化醛的氫氘代反應(yīng)合成氘代醛的方法（圖5）。

圖5 ThDP依賴酶催化的氘代醛合成Fig.5 ThDP-dependent enzyme-catalyzed synthesis of deuterated aldehydes

2 還原氘代

還原酶是一種從供體分子上轉(zhuǎn)移氫到催化底物上從而發(fā)生加氫反應(yīng)的酶。結(jié)合所用還原酶的催化機理，通過還原步驟將氘引入特定的位點是一種巧妙的生物氘代方法。2002 年，MacDonald等［78］提出了一種使用來自Lactobacillus leichmannii的三磷酸核苷酸還原酶（ribonucleotide triphosphate reductase，RTPR）將13C/15N 標(biāo)記的三磷酸核糖核苷酸（dNTPs）的2′位置羥基還原氘代的方法。當(dāng)還原過程在D2O 中進行時，2′位置引入氘原子而不是通常的氫原子。后續(xù)通過串聯(lián)使用脫氧尿苷5′-三磷酸核苷水解酶（dUTPase）和胸苷酸合成酶（thymidylate synthase）合成了帶有13C/15N 標(biāo)記的［2′-D］dATP、dGTP 和dCTP［圖6（a）］，產(chǎn)率達到95%。采用標(biāo)準(zhǔn)的酶法將dTMP 轉(zhuǎn)換為dTTP［圖6（b）］［79］，總產(chǎn)率達到80%。使用該方法制備的氘代核苷酸已被用于分段標(biāo)記腺病毒晚期啟動子的20-BPDNA螺旋。

圖6 氘代三磷酸核糖核苷酸（dNTPs）的合成路線Fig.6 Synthesis of deuterated dNTPs

許多氧化還原酶都依賴于煙酰胺輔因子循環(huán)。應(yīng)用氘代的還原態(tài)NAD（P）H 能夠有效地將氘元素插入不飽和鍵中，一步構(gòu)建手性氘代化合物。2006 年，Edegger 等［80］利用生物催化方法，以d8-2-丙醇為氘源，由酮一步制備了嚴(yán)格S-選擇性的氘代仲醇，該課題組發(fā)現(xiàn)了1 種來自赤紅球菌DSM 44541的高有機溶劑耐受性醇脫氫酶ADH，與常用的醇脫氫酶相比，ADH 對多種酮均有較高的產(chǎn)率和接近99%產(chǎn)物立體選擇性。他們選擇d8-2-丙醇為氘供體，利用d8-異丙醇與d6-丙酮的氧化還原循環(huán)了NADD 與NAD（圖7），對一系列芳香酮和烷基酮完成了300 mg 規(guī)模的催化反應(yīng)，分離產(chǎn)率達到70%～89%，ee均在99%以上。

圖7 利用氘代NADH合成手性氘代仲醇Fig.7 Synthesis of deuterated alcohols with deuterated NADH

然而，由于還原性NADH 中的氫原子不是活潑氫，因此將氘引入NADH 并進行下一步的還原反應(yīng)通常需要價格昂貴的氘代醇（氘代乙醇、丙醇、葡萄糖）作為氘源［81-82］，嚴(yán)重影響反應(yīng)的經(jīng)濟性。如何通過簡單的策略將廉價氘源D2O中的氘元素引入NAD（P）成為研究者們重點關(guān)注的問題。2019 年，來自牛津大學(xué)的Vincent 教授課題組［83］采用了氫化酶驅(qū)動的NAD+還原策略，將氫化酶氧化過程中產(chǎn)生的電子通過碳載體傳遞至NAD+還原酶，并結(jié)合氘水將氘成功引入NADH，并串聯(lián)其他NADP 依賴型的還原酶進一步構(gòu)建多種手性氘代分子（圖8）。值得一提的是，Vincent 教授課題組［84］通過該策略成功構(gòu)建了氘代的R-3-喹核醇中間體，并將其應(yīng)用于藥物Solifenacin fumarate 的制備，證明了該系統(tǒng)在藥物合成上的重要意義。

圖8 利用NAD+還原酶合成氘代NADH應(yīng)用于氘代仲醇的合成Fig.8 Synthesis of deuterated NADH with NAD+reductase for the subsequent production of deuterated secondary alcohols

該課題組［85］在后續(xù)工作中應(yīng)用電化學(xué)策略進一步研究了這種通過氫化酶從氘水將氘引入NADH 的方法。他們通過對石墨電極的修飾構(gòu)建了3 種系統(tǒng)用以制備氘代NADH：生物催化系統(tǒng)（NiFe 氫化酶和NAD+還原酶）、電生物催化系統(tǒng)（Pt/C 和NAD+還原酶）以及完全電化學(xué)催化系統(tǒng)（Pt/C），并評估了它們在驅(qū)動還原氘化反應(yīng)時的化學(xué)選擇性和立體選擇性。結(jié)果表明，電生物催化系統(tǒng)的區(qū)域選擇性和立體選擇性與生物系統(tǒng)完全相同。此外，電生物催化系統(tǒng)與電化學(xué)催化相比具有明顯優(yōu)勢，它只產(chǎn)生S構(gòu)型的氘代NADH，并且無副產(chǎn)物產(chǎn)生［86-88］；與單純的生物催化系統(tǒng)相比，它顯示出更高的催化活性。作者使用了兩種對NADH 選擇性相反的醇脫氫酶進行級聯(lián)反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（R）-ADH 從煙酰胺環(huán)的4S位置獲取氘生成R-氘代醇（圖9），但是（S）-ADH 只能從煙酰胺環(huán)的4R位置獲取氫生成未氘代的S構(gòu)型醇。作者進一步增加第二次輔因子循環(huán)系統(tǒng)，產(chǎn)生了雙氘代的還原輔助因子NADH（圖9），從而實現(xiàn)了S-氘代醇的合成。

圖9 多酶催化合成手性構(gòu)型互補的氘代仲醇Fig.9 Multi-enzymatic synthesis of deuterated secondary alcohols with complementary configurations.

流動化學(xué)因其具有操作性簡便、反應(yīng)可控、重現(xiàn)性好等優(yōu)點而被廣泛用于有機合成領(lǐng)域（圖10）［89-90］，近年來也越來越多地被用于生物催化中。Vincent課題組［91］將游離的氫化酶和NADH依賴型還原酶固定在碳納米管柱上，由H2驅(qū)動，D2O為氘源，結(jié)合醇脫氫酶和亞胺還原酶，成功將氘元素引入一系列手性醇和胺中。然而，隨著反應(yīng)的進行，氫化酶活性逐漸喪失，反應(yīng)的效率逐漸降低，后期對氫化酶穩(wěn)定性的改造將進一步提升該方法的應(yīng)用價值。

圖10 碳表面固定化酶的流動反應(yīng)器實現(xiàn)氫氣驅(qū)動的氘代化合物合成Fig.10 Heterogeneous biocatalytic deuteration driven by H2 in a flow reactor containing carbon support-immobilized enzymes.

Al-Shameri 等［92］同樣采用流動化學(xué)手段開發(fā)了一種體外酶級聯(lián)合成反應(yīng)器。在該研究中，作者將NADH依賴性的亞胺還原酶（imine reductase，IRED）PuO 的E203G 突變體與耐氧的NAD 還原氫化酶（SH）耦合，由H2驅(qū)動從二胺中產(chǎn)生多種哌啶衍生物，產(chǎn)率達到99%。當(dāng)以D2O 作為氘源時，產(chǎn)生的氘代NADH 可以作為體系中各種NADH 依賴性還原酶的輔因子來產(chǎn)生氘化化合物，產(chǎn)物具有高達99%的氘標(biāo)記率（圖11）。

圖11 流動化學(xué)制備氘代哌啶衍生物Fig.11 Preparation of deuteropiperidine derivatives through the flow chemistry process

3 脫羧氘代

羧酸具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、廉價易得等優(yōu)點，且在其參與的脫羧反應(yīng)中，位點明確，副產(chǎn)物僅有無毒的二氧化碳?xì)怏w。因此，長期以來都被研究者們作為構(gòu)建其他功能型化合物的理想原料。脫羧氘代是將氘元素特異性引入有機小分子的一個重要策略?；瘜W(xué)脫羧氘代反應(yīng)常常需要使用鈀、銀等貴金屬催化劑（圖12）［93-94］，而在一些使用廉價的銅催化劑催化的脫羧氘代反應(yīng)中則需要特別高的溫度和昂貴的配體［95］。近年來，一些溫和的光催化脫羧氘代反應(yīng)實現(xiàn)從游離羧酸制備氘代產(chǎn)物也不斷被報道［96］。雖然化學(xué)催化脫羧氘代反應(yīng)已經(jīng)有很好的發(fā)展，但是生物催化的脫羧氘代反應(yīng)仍然比較少。據(jù)我們所知，目前主要有氨基酸脫羧酶和光敏脂肪酸脫羧酶催化的兩類脫羧氘代反應(yīng)被報道。

圖12 銀催化的苯甲酸衍生物脫羧氘代反應(yīng)Fig.12 Ag(I)-catalysed deutero-decarboxylations of benzoic acids.

早 在1960 年，Belleau 等［97］就 曾 經(jīng) 報 道 過L-氨基酸的酶促脫羧氘代反應(yīng)，并且確認(rèn)了脫羧氘代反應(yīng)過程中α-C的立體結(jié)構(gòu)是保持不變的。很多氨基酸脫羧酶都是磷酸吡哆醛（PLP）依賴的，它們催化脫羧反應(yīng)的過程如圖13 所示。以酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase）為例，首先PLP 與酪氨酸脫羧酶的賴氨酸殘基形成內(nèi)部的醛亞胺，當(dāng)酪氨酸進入底物結(jié)合口袋后，PLP即與酪氨酸結(jié)合形成外部的醛亞胺，然后脫羧形成醌型中間體，不穩(wěn)定的醌型中間體會進一步轉(zhuǎn)變?yōu)槔野放cPLP結(jié)合的醛亞胺狀態(tài)，期間奪取一個氘代質(zhì)子（D+）從而實現(xiàn)氘代，最后將產(chǎn)物氘代酪胺釋放出來，PLP 重新生成與賴氨酸殘基結(jié)合的內(nèi)部醛亞胺形式［98］。波蘭華沙大學(xué)的Kańska 教授對氨基酸脫羧酶催化的脫羧氘代反應(yīng)進行較系統(tǒng)的研究。2007年Kańska課題組［63］報道了生物法合成氘代酪氨酸、酪胺的路線。首先利用色氨酸酶將氘原子引入羧基的α位置，接著酪氨酸脫羧酶催化標(biāo)記的L-酪氨酸脫羧生成酪胺［圖14（a）］。在脫羧過程中所有產(chǎn)物，均保留了S構(gòu)型。

圖13 酪氨酸脫羧酶催化脫羧氘代反應(yīng)機理Fig.13 Mechanism of tyrosine decarboxylase-catalyzed decarboxylation deuteration

多巴胺（DA）參與了去甲腎上腺素和腎上腺素等兒茶酚胺神經(jīng)遞素的酶合成途徑，其衍生物是治療阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥等健康問題的基本藥物［99-102］。為了研究脫羧機制以及多巴胺的后續(xù)衍生機制，2009年Kańska等［64］通過控制反應(yīng)體系的同位素來源分別合成了氘代、氚代、氚氘二取代的同位素標(biāo)記L-酪氨酸、L-多巴和DA。將L-酪氨酸溶解在全氘化的K2DPO4緩沖液中，加入色氨酸酶進行羧基α位置氘交換，將獲得的［2-D］-L-酪氨酸在酪氨酸酶催化下羥基化，生成［2-D］-L-多巴，在酪氨酸脫羧酶催化下即可獲得［（1S）-D］-DA。因為脫羧反應(yīng)可以保持原α-C 的立體結(jié)構(gòu)［圖14（b）］［103-104］，所以如果將L-多巴在氘水環(huán)境中用酪氨酸脫羧酶催化脫羧即可獲得［（1R）-D］-DA［圖14（c）］。

圖14 氨基酸脫羧酶催化脫羧氘代反應(yīng)合成氘代酪胺、多巴和色胺衍生物Fig.14 Amino acid decarboxylase-catalyzed synthesis of deuterated tyramine,DOPA,and tryptamine derivatives

色胺是哺乳動物大腦中一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，在生物體內(nèi)是被L-苯丙氨酸脫羧酶催化，由L-色氨酸脫羧生成的，通過生物加工還可以合成血清素、褪黑素等生物活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)中的氫很容易被鹵素取代，而生物活性不發(fā)生改變，所以被鹵素取代且被氘代或氚代的色胺及其衍生物被運用在許多具有重要生物意義的途徑中，比如用于生產(chǎn)核醫(yī)學(xué)放射性藥物和正電子發(fā)射斷層掃描。Kańska課題組［105］應(yīng)用L-苯丙氨酸脫羧酶催

2021年本課題組［107］報道了一種使用光脫羧酶CvFAP 催化的脫羧氘代方法。通過利用從小球藻NC64A 中獲得的光脫羧酶CvFAP，以廉價的重水作為氘源，實現(xiàn)了多種羧酸的脫羧氘化（圖15）。CvFAP含有的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子能吸收藍(lán)光形成激發(fā)態(tài)FAD*，從而催化長鏈脂肪酸脫羧形成自由基，精氨酸殘基含有的活潑氫被氘代從而可以提供一個氘質(zhì)子，同時激發(fā)態(tài)FAD*發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，使得該自由基生成烷烴產(chǎn)物并釋放出來，進而生成相應(yīng)的氘代烷烴或者烯烴［108-109］。但是該酶的底物譜比較窄，對長鏈脂肪化合成9 個色胺及其鹵素衍生物的脫羧氘代方法，并且產(chǎn)物保留了α-碳的立體構(gòu)型［圖14（d）］。類似的方法還被應(yīng)用于組胺的脫羧氘代反應(yīng)過程中［106］。

圖15 光敏脂肪酸脫羧酶CvFAP催化的氘代脫羧反應(yīng)Fig.15 Decarboxylative deuteration catalyzed by CvFAP

酸的活性最好，而對中短鏈或者芳香族羧酸的活性比較低。我們利用聚焦理性迭代定點突變（focused rational iterative site-specific mutagenesis，F(xiàn)RISM）的策略對WT-CvFAP實施了蛋白質(zhì)工程化改造，將酶催化的底物范圍從長鏈脂肪酸擴展到中鏈羧酸、短鏈羧酸和芳香酸。與野生型相比，得到的I398L 突變體可以將催化壬酸的反應(yīng)活性提高10倍，G462A突變體可以將丙酸的產(chǎn)率從3%提高到78%，Y466A 突變體將3-苯基丁酸的產(chǎn)率從3%提高到81%，并實現(xiàn)了立體選擇性互補的脫羧氘代反應(yīng)。進一步用分子動力學(xué)模擬解釋了WT-CvFAP 和突變體催化活性和立體選擇性的結(jié)果。最后，將建立的方法用于4種天然產(chǎn)物的脫羧氘代反應(yīng)中，都達到了約90%的氘代結(jié)果。

4 其他氘代方法

雙鍵的加成也是引入同位素標(biāo)記的重要方式之一。苯丙氨酸氨裂解酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）可以催化1-苯丙氨酸消除氨基生成E-肉桂酸，在添加銨離子的體系中也可以催化其加胺的可逆反應(yīng)［110-115］。如果使用含有重水或氚水的緩沖液，即可獲得S構(gòu)型的同位素標(biāo)記苯丙氨酸（圖16）［116］。后續(xù)串聯(lián)苯丙氨酸脫氫酶PheDH（phenylalanine dehydrogenase）可以得到被標(biāo)記的苯丙酮酸［117］。

圖16 制備氘代S-苯丙氨酸和苯丙酮酸Fig.16 Preparation of deuterated(S)-phenylalanine and phenylpyruvic acid

由于PAL 催化時的立體專一性，通過上述步驟只能獲得S構(gòu)型的苯丙氨酸，為了獲得R構(gòu)型產(chǎn)物，Jemielity 等［116］結(jié)合化學(xué)法和酶法解決了這個問題。首先用化學(xué)方法制備了帶有同位素標(biāo)記的E-肉桂酸，最后一步結(jié)合PAL 制備了R構(gòu)型產(chǎn)物（圖17）。

圖17 制備氘代R-苯丙氨酸Fig.17 Preparation of deuterated(R)-phenylalanine

5 總結(jié)與展望

化學(xué)法制備氘代化合物的方法相對豐富，現(xiàn)在唯一上市的氘代藥物丁苯那嗪就是采取了化學(xué)方法引入氘原子。而生物法制備氘代化合物的研究才剛剛起步，仍不成熟。綜上所述，目前已報道的生物氘代方法主要分為酶催化的氫氘交換、還原氘代與脫羧氘代。氫氘交換方法大多在羰基的α位置引入同位素標(biāo)記，適用于氘代氨基酸的制備。還原氘代多使用NADH 依賴的還原酶，通過提供氘代醇或者重水作為氘源，利用輔酶循環(huán)將氘原子引入NADH 中，經(jīng)過還原步驟將氘轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物分子中，這個方法可以很好地保留所用酶的立體選擇性，生成手性氘代分子，滿足了氘代藥往往需要手性中心的現(xiàn)狀。脫羧氘代方法則是另一類高效定點引入氘元素的策略，其中包括最新報道的光脫羧酶，經(jīng)過蛋白質(zhì)工程改造后的突變體適用于廣泛的帶羧基底物的脫羧氘代反應(yīng)，并且對于多種天然產(chǎn)物均有較高的氘代效果，顯示了其在氘代藥中的應(yīng)用潛力。

雖然生物催化方法彌補了化學(xué)氘代方法步驟復(fù)雜、控制立體選擇性困難、毒性大等缺陷，然而生物酶仍存在本身難以忽略的問題。酶雖然具有極高的催化活性，但是其對保持活性的存儲溫度和反應(yīng)條件的需求較為苛刻，制約了其商業(yè)化所需的長距離運輸和長時間儲存，并且不利于在工業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模運用。另外，酶的專一性致使即使現(xiàn)在出現(xiàn)了理性設(shè)計這一突變方法，仍很難避免尋找最優(yōu)突變株過程中需要較大的工作量和時間。尋找底物適配的突變體和提高酶在反應(yīng)中的穩(wěn)定性是生物催化氘代反應(yīng)中急需解決的兩大問題。此外，氘代藥的未來也存在一些需要克服的困難。首先，專利申請難度大。根據(jù)同位素效應(yīng)，當(dāng)分子中的氫被氘取代后，其分解速率減慢改善代謝的效果被認(rèn)為是可預(yù)見的，因此缺乏創(chuàng)新性，所以如果藥物在到氘代后沒有新的意外的發(fā)現(xiàn)，專利申請很可能會被駁回。其次，氘代并不一定能改善藥物的性能。如果代謝途徑不涉及碳氘鍵斷裂則無法減緩代謝速率，這要求氘原子需要具備精準(zhǔn)的插入位置，將氘引入主要代謝點上。另外，由于無法預(yù)測藥物在體內(nèi)的代謝路徑中是否會發(fā)生代謝位點的遷移，這一變量為氘代藥物的設(shè)計增加了難度。因此，相關(guān)藥理學(xué)及藥物代謝的機理是該研究的重要基礎(chǔ)。

即使如此，酶的生物催化方法也有其獨特的優(yōu)勢：反應(yīng)條件溫和，以重水為氘源廉價無毒，能一步制備氘代分子，具有較高的區(qū)域、立體選擇性，與現(xiàn)有的化學(xué)催化氘代策略相比是一個重大進步。由此可預(yù)見，生物催化將成為不斷發(fā)展的氘代化合物合成領(lǐng)域的一個強大的技術(shù)補充。由于氘代分子在醫(yī)藥、化學(xué)中的重要地位，相信生物催化氘代反應(yīng)在未來將會得到越來越廣泛的應(yīng)用。