Fe/α-酮戊二酸依賴(lài)型鹵化酶在綠色鹵化反應(yīng)中的研究進(jìn)展

王匯濱，車(chē)昌麗，游松

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

自100 多年前首次發(fā)現(xiàn)含鹵素天然產(chǎn)物以來(lái)，目前已有5000多種含鹵素天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)和鑒定，其中包括強(qiáng)效抗菌劑如萬(wàn)古霉素和氯霉素等［1］。并且大約40%的小分子藥物和約30%的農(nóng)用化學(xué)品含有鹵素，代表性含鹵素重磅炸彈藥物如恩格列凈、氯吡格雷和孟魯司特等［2-4］。鹵素的摻入會(huì)顯著改變化合物的物理化學(xué)特性并可能影響其生物學(xué)活性、代謝途徑和藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征等［5］。此外碳鹵鍵是有機(jī)合成反應(yīng)中一類(lèi)重要的合成砌塊，可用于后續(xù)金屬催化的交叉偶聯(lián)反應(yīng)和親核取代反應(yīng)等［6-7］。在聚合物中引入鹵素單元可以有效提高其方向性和內(nèi)在疏水性，含鹵素材料在下一代材料設(shè)計(jì)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛［8-10］。因此，小分子化合物的選擇性鹵化反應(yīng)在藥物、農(nóng)藥、材料等制造領(lǐng)域具有重要意義。然而，常見(jiàn)的化學(xué)鹵化方法存在原子效率低、選擇性低、毒性高、環(huán)境污染等問(wèn)題［11-13］。

采取生物催化方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)鹵化方法會(huì)提供一種選擇性更高、更高效環(huán)保的鹵化物分子合成工藝路線［14-16］。生物催化鹵化反應(yīng)主要由鹵過(guò)氧化物酶、氧氣依賴(lài)型鹵化酶和氟化酶等催化，根據(jù)其催化機(jī)制具體分為：遵循親電芳香取代機(jī)制（electrophilic aromatic substitution，SEAr）的亞鐵血紅素依賴(lài)型、釩依賴(lài)型和黃素依賴(lài)型，遵循自由基機(jī)制（radical rebound）的Fe/αKG 依賴(lài)型和遵循親核機(jī)制（nucleophilic substitution，SN2）的S-腺 苷-L-甲硫 氨酸［（S）-adenosyl methionine，SAM］依賴(lài)型等［17-21］（圖1）。在親電反應(yīng)中，鹵過(guò)氧化物酶以過(guò)氧化氫和鹵化物作為共底物，利用游離的次鹵酸鹽（XO?）作為鹵化物種對(duì)芳香性和富電子底物進(jìn)行非特異性鹵化反應(yīng)，黃素依賴(lài)型鹵化酶以氧氣、FADH2和鹵化物作為共底物，利用固定在活性位點(diǎn)的次鹵酸鹽（XO?）作為鹵化物種對(duì)芳香性和富電子底物進(jìn)行區(qū)域選擇性鹵化反應(yīng)［圖1（a）］。在自由基反應(yīng)中，F(xiàn)e/αKG依賴(lài)型鹵化酶以氧氣、αKG 和鹵化物作為共底物，利用鹵素自由基（X·）作為鹵化物種對(duì)脂肪族底物進(jìn)行區(qū)域和立體選擇性鹵化反應(yīng)［圖1（b）］。在親核反應(yīng)中，SAM 依賴(lài)型鹵化酶以SAM 和鹵化物作為底物，利用親核鹵化物（X?）作為鹵化物種對(duì)親電子底物進(jìn)行鹵化反應(yīng)［圖1（c）］。

圖1 不同類(lèi)型鹵化酶及其相關(guān)反應(yīng)特征匯總Fig.1 Summary of different types of halogenases and their related reaction characteristics

本綜述將重點(diǎn)關(guān)注基于自由基催化機(jī)制的Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶在綠色鹵化反應(yīng)中的研究進(jìn)展，與其他類(lèi)型鹵化酶相比，它可以通過(guò)形成強(qiáng)氧化劑Fe（Ⅳ）＝O ferrel 中間體基于自由基機(jī)制區(qū)域和立體選擇性鹵化脂肪族底物［22-24］。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)已發(fā)現(xiàn)的鹵化天然產(chǎn)物中大約一半與鹵素結(jié)合的碳原子是sp3雜化的，區(qū)域和立體選擇性鹵化反應(yīng)對(duì)天然產(chǎn)物高效合成至關(guān)重要，但對(duì)未經(jīng)活化的C－H 鍵選擇性鹵化充滿(mǎn)挑戰(zhàn)［6，25-27］。鹵代烷的傳統(tǒng)化學(xué)合成方法包括利用相應(yīng)的醇［28］、烯烴［29-30］和酸［31-32］進(jìn)行官能團(tuán)轉(zhuǎn)化，現(xiàn)代化學(xué)合成方法包括光驅(qū)動(dòng)［33-35］和過(guò)渡金屬催化等［36-39］。然而，這些合成合成方法存在立體選擇性低并且反應(yīng)條件苛刻等問(wèn)題［35，40］。相比之下，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶作為生物催化劑可以在溫和條件下高區(qū)域和立體選擇性鹵化未經(jīng)活化的sp3雜化碳中心，為脂肪族底物的生物催化鹵化策略開(kāi)辟新的方向。本文通過(guò)對(duì)Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶催化的天然反應(yīng)以及基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程改造實(shí)例等展開(kāi)分析總結(jié)，豐富鹵化反應(yīng)的酶工具箱。

1 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的發(fā)現(xiàn)與分類(lèi)

Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶具體分為載體蛋白依賴(lài)型（carrier protein dependent）如Barbamide 生物合成途徑中的BarB1［41］、BarB2［41］，Syringomycin E（丁香霉素E）生物合成途徑中的SyrB2［42］，Armentomycin 生 物 合 成 途 徑 中 的CytC3［43］，Hectochlorin（乙酰氯素）生物合成途徑中的HctB［44］，Coronatine（冠堿）生物合成途徑中的CmaB［45］，Kutzneride 2 生物合成途徑中的KthP、KtzD，Curacin A 生 物 合 成 途 徑 中 的CurA［46］，Jamaicamide 生物合成途徑中的JamE 等和獨(dú)立型（free standing）如Welwitindolinone 生物合成途徑中 的WelO5［47］、 WelO5*［48］、Wi-WelO15［49］，Ambiguine 生 物 合 成 途 徑 中 的AmbO5［50］，Adechlorin 生 物 合 成 途 徑 中 的AdeV［51］，（?）-Acutumine 生 物 合 成 途 徑 中 的SaDAH［52］，βethynylserine（β-乙炔絲氨酸）生物合成途徑中的BesD［53］等。基于自由基機(jī)制的Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶可以選擇性活化含sp3雜化的碳?xì)滏I，1998 年Gerwick 課 題 組［54］在 來(lái) 源 于 巨 大 鞘 絲 藻L.majuscula的天然產(chǎn)物Barbamide結(jié)構(gòu)中首次發(fā)現(xiàn)含有三鹵化甲基的亮氨酸結(jié)構(gòu)單元，推測(cè)其生物合成途徑中可能存在未被鑒定的鹵化酶催化含sp3雜化的碳?xì)滏I發(fā)生鹵化反應(yīng)。該課題組利用同位素標(biāo)記亮氨酸并進(jìn)行底物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)亮氨酸的pro-S甲基沒(méi)有與親電試劑反應(yīng)，表明碳鹵鍵形成機(jī)制與之前鑒定的鹵化酶完全不同，提出了基于自由基機(jī)制區(qū)域選擇性催化Barbamide 三氯甲基部分的形成。2006 年Drennan 課題組［42］首次解析Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶SyrB2的晶體結(jié)構(gòu)，其參與來(lái)源于丁香假單胞菌Pseudomonas syringaepv.syringaeB301D 中丁香霉素E 的生物合成途徑。2014 年Liu 課題組［55］在來(lái)源于Hapalosiphon welwitschiiUTEX B1830的Hapalindole類(lèi)生物堿生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了首例獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶WelO5。2019 年Chang 課題組［53］發(fā)現(xiàn)并表征氨基酸鹵化酶BesD，其屬于Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶家族。對(duì)上述載體蛋白依賴(lài)型和獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明這兩大分支之間同源性較低，并且不同種類(lèi)的載體蛋白依賴(lài)型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶同源性較高，而不同種類(lèi)的獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶同源性較低（圖2）。自然界通過(guò)進(jìn)化產(chǎn)生豐富多樣的Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶，這類(lèi)鹵化酶不僅具有一定的底物寬泛性，而且有望發(fā)展成為高效的生物催化劑。

圖2 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶序列一致性比對(duì)結(jié)果（利用MEGAX Version 10.2.4軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)并通過(guò)Clustal 2.1程序分析序列一致性）Fig.2 Sequence identity matrix of Fe/αKG-dependent halogenases(Multiple sequence alignments were created by MEGAX Version 10.2.4 and the similarity percentage of the sequence identity matrix was analyzed by Clustal 2.1).

2 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的天然反應(yīng)

2.1 載體依賴(lài)型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶

2.1.1 終產(chǎn)物中含有鹵素

載體依賴(lài)型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶催化通過(guò)共價(jià)連接到磷酸泛酰巰基乙胺臂［phosphopantetheine（Ppant）arm］的酰基或肽基載體蛋白類(lèi)底物。首先對(duì)非核糖體肽生物合成途徑中的載體依賴(lài)型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶進(jìn)行歸納總結(jié)，在丁香霉素E 生物合成過(guò)程中，SyrB2 催化LThr-SyrB1 的甲基一氯化生成4-Cl-L-Thr-SyrB1 并且不接受L-蘇氨酸作為底物，說(shuō)明SyrB2催化底物需束縛到鹵素-SyrB1 硫醇化結(jié)構(gòu)域的磷酸鹽臂上以進(jìn)行氯化［42，56］［圖3（a）］。

Barbamide的生物合成途徑中涉及兩個(gè)Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶BarB1 和BarB2，它們協(xié)同催化LLeu-（S）-BarA的C5位甲基發(fā)生三氯化反應(yīng)。BarB2可以催化L-Leu-（S）-BarA和一氯化Leu-（S）-BarA氯化生成二氯化Leu-（S）-BarA，而B(niǎo)arB1可以同時(shí)催化一氯化和二氯化L-Leu-（S）-BarA 生成（2S，4S）-5，5，5-三氯-Leu-（S）-BarA，表明BarB1 和BarB2 可以催化引入不同數(shù)量的鹵素原子［41］［圖3（b）］。

在來(lái)源于鏈霉菌的抗生素Armentomycin 生物合成過(guò)程中，CytC3 催化L-氨基丁酰-（S）-CytC2 的氯化反應(yīng)，與SyrB2、BarB1和BarB2類(lèi)似，CytC3可以催化生成γ-氯-和γ，γ-二氯氨基丁酰-（S）-CytC2，序列比對(duì)結(jié)果表明CytC3 和SyrB2 具有較高的同源性（一致性為58%，相似性為71%）［43，57］［圖3（c）］。

除了上述非核糖體肽合成酶相關(guān)案例外，氯化酶可以參與其他類(lèi)型天然產(chǎn)物的生物合成途徑。脂肪?；u化酶HctB 參與來(lái)源于巨大鞘絲藻L.majuscula中乙酰氯素的生物合成，HctB 蛋白結(jié)構(gòu)包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N 末端Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶結(jié)構(gòu)域、?；o酶A 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和酰基載體蛋白結(jié)構(gòu)域。當(dāng)使用與ACP 連接的己?；鳛榈孜飼r(shí)，HctB可以催化生成5-oxo-（S）-ACP、5-chloro-4-vinyl-（S）-ACP 和5,5-dichloro-hexanoyl-（S）-ACP［44］［圖3（d）］。在Kutzneride 2 的生物合成途徑中，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶KthP 區(qū)域和立體選擇性催化環(huán)狀底物哌嗪基的氯化反應(yīng)，生成（3S，5S）-5-氯哌酸-（S）-KtzC［58］［圖3（e）］。

圖3 載體依賴(lài)型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶參與含鹵天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.3 Carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products

2.1.2 終產(chǎn)物中含有環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)

除上述在最終天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中含有鹵素原子外，天然產(chǎn)物可以在其生物合成途徑中通過(guò)形成隱秘的關(guān)鍵氯化物中間體以用于后續(xù)碳碳鍵形成反應(yīng)，代表性案例為通過(guò)引入氯原子以形成環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)［59］。含有空間剛性環(huán)丙烷的氨基酸是一類(lèi)重要的合成砌塊［60］，可用于激素、肽類(lèi)及酶抑制劑等藥物的合成過(guò)程，以避免被體內(nèi)酶降解并改善生物物理特性［61］，通過(guò)合成生物學(xué)途徑構(gòu)建非天然環(huán)丙烷氨基酸及其衍生物具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

在丁香假單胞菌毒素冠堿生物合成途徑中，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶CmaB 催化L-allo-Ile-（S）-CmaD 氯化生成γ-氯-L-allo-Ile-（S）-CmaD，隨后通過(guò)鋅依賴(lài)性酶CmaC催化γ-消除反應(yīng)生成冠狀酸-SCmaD，之后冠狀酸從CmaD 中釋放并作為冠堿的關(guān)鍵生物合成砌塊［45，57］［圖4（a）］。

Kutzneride 2 的生物合成途徑與冠堿生物合成途徑類(lèi)似，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶KtzD 催化L-Ile-（S）-KtzC 的γ 位發(fā)生氯化反應(yīng)生成γ-Cl-L-Ile-（S）-KtzC，隨后在黃素依賴(lài)型?；o酶A 脫氫酶KtzA作用下生成含環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的（1S，2R）-allo-CMAKtzC［62］［圖4（b）］。

大自然在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了種類(lèi)繁多的次級(jí)代謝產(chǎn)物，同時(shí)編碼生物合成的基因簇存在平行相互作用關(guān)系，大自然采取的共同進(jìn)化策略進(jìn)一步豐富了天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性［63-64］。來(lái)源于巨大鞘絲藻L.majuscula的Curacin A和Jamaicamide具有相同的起始生物合成途徑，聚酮合酶中的鹵化酶結(jié)構(gòu)域CurA 和JamE 均可催化HMG-（S）-ACP 生成一氯化產(chǎn)物，兩者序列一致性為90%，之后在脫水酶結(jié)構(gòu)域CurE 或JamI 作用下生成3-methylglutaconyl-ACP。在Curacin A 生物合成途徑中，上述前體在CurF結(jié)構(gòu)域中脫羧酶作用下生成含α，β-烯酰硫酯結(jié)構(gòu)的3-methylcrotonyl-ACP，最終在CurF 結(jié)構(gòu)域中烯酰還原酶作用下發(fā)生環(huán)丙烷化。而在Jamaicamide生物合成途徑中，3-methylglutaconyl-ACP 在JamJ結(jié)構(gòu)域中脫羧酶作用下生成含β，γ-烯酰硫酯結(jié)構(gòu)的中間體［46，65-66］［圖4（c）］。

圖4 載體依賴(lài)型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶參與催化含有環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.4 Carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products featuring cyclopropane scaffold

2.2 獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶

來(lái)源于Hapalosiphon welwitschiiUTEX B1830的Welwitindolinone A 生物堿生物合成途徑中的WelO5是第1個(gè)被鑒定的獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶，其可以區(qū)域選擇性和立體選擇性地氯化12-epi-Fischerindole U 和12-epi-Hapalindole C 的脂肪 碳 原子，分別生成12-epi-Fischerindole G 和12-epi-Hapalindole E，并在分子中產(chǎn)生一個(gè)新的立體中心［47，55］。通過(guò)基因挖掘從產(chǎn)生Ambiguine生物堿的Fischerella ambiguaUTEX1903 中發(fā)現(xiàn)了AmbO5，與WelO5相比，AmbO5具有更寬泛的底物譜，可以選擇性催化Hapalindole、Fischerindole和Ambiguine等不同類(lèi)型生物堿的鹵化反應(yīng)［50，67］［圖5（a）］。

獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶不僅可以催化分子量較大的生物堿發(fā)生鹵化反應(yīng)，而且可以催化小分子氨基酸發(fā)生鹵化反應(yīng)。氨基酸鹵化酶BesD參與卡特蘭鏈霉菌Streptomyces cattleya中β-乙炔絲氨酸的生物合成，催化L-賴(lài)氨酸的γ位發(fā)生氯化反應(yīng)［68］。BesD 與其他獨(dú)立型鹵化酶如WelO5（9%）具有較低的序列一致性，但其與Fe/αKG 依賴(lài)型加氧酶同源性更高。通過(guò)生物信息學(xué)方法以BesD 為模板進(jìn)行聚類(lèi)并篩選分析其同源序列，相關(guān)候選酶被分為8 個(gè)不同的簇（HalA～HalH），來(lái)自HalA～HalG的19個(gè)候選酶可以區(qū)域選擇性催化不同氨基酸如L-賴(lài)氨酸、L-鳥(niǎo)氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-正亮氨酸等的氯化反應(yīng)，而來(lái)自HalH 的2種候選酶沒(méi)有表現(xiàn)出氨基酸鹵化酶活性［53］，以上結(jié)果表明Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶可以區(qū)域選擇性催化多種類(lèi)型的氨基酸發(fā)生鹵化反應(yīng)［圖5（b）］。

2019 年張勇慧課題組［51］在來(lái)源于放線菌Actinomadurasp.ATCC 39365 的含鹵素天然產(chǎn)物Adechlorin 生物合成途徑中發(fā)現(xiàn)了首例鹵化核苷的Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶AdeV。AdeV 與WelO5 具有15%的相似性。AdeV催化游離核苷2′-deoxyadenosine monophosphate（2′-dAMP）發(fā)生鹵化反應(yīng)生成Cl-2′-dAMP。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不含磷酸基團(tuán)部分的2′-deoxyadenosine（2′-dA）不與AdeV 反應(yīng)，證實(shí)磷酸鹽結(jié)構(gòu)對(duì)于底物識(shí)別和鹵化反應(yīng)至關(guān)重要。此 外 兩 種 磷 酸 化 核 苷2′，3′-dideoxyadenosine-5′-monophosphate 和2′-deoxyinosine-5′-monophosphate（2′-dIMP）也能與AdeV 反應(yīng)并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)氯化產(chǎn)物，但是只有天然底物2′-dAMP 活性較高，未來(lái)進(jìn)一步改造Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶可以豐富核苷酸骨架的多樣性［圖5（c）］。

植物來(lái)源鹵化天然產(chǎn)物非常罕見(jiàn)，2020 年Weng 課題組［52］從防己科植物中發(fā)現(xiàn)并鑒定Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶SaDAH（dechloroacutumine halogenase）， 其 催 化 四 環(huán) 氯 代 生 物 堿（?）-acutumine 生物合成的最終氯化步驟。此外系統(tǒng)發(fā)育分析表明，DAH 在防己科植物和細(xì)菌中分別獨(dú)立進(jìn)化，表明不同生命領(lǐng)域的代謝途徑采取平行進(jìn)化策略，并且這類(lèi)鹵化反應(yīng)為擴(kuò)展植物化學(xué)多樣性提供了新的思路［圖5（d）］。

圖5 獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶參與含鹵天然產(chǎn)物的生物合成途徑Fig.5 Non-carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases involved in the biosynthetic pathway of halogen-containing natural products

3 Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理

3.1 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的結(jié)構(gòu)

Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶屬于Fe/αKG依賴(lài)型加氧酶超家族成員，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型加氧酶可以催化羥基化、環(huán)氧化、差向異構(gòu)化、去甲基化、環(huán)化等多種反應(yīng)［69］。迄今為止，不同類(lèi)型的Fe/αKG 依賴(lài)型 鹵 化 酶SyrB2［42］、 CytC3［43］、 CurA［70］和WelO5［47］、Wi-WelO15［49］、BesD［53］等的晶體結(jié)構(gòu)已通過(guò)X 射線衍射進(jìn)行解析，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶具有Fe/αKG 依賴(lài)型加氧酶典型的DSBH（distorted double-stranded β-helix）桶狀核心結(jié)構(gòu)特征，底物和共底物位于DSBH 核心，外面被α 螺旋和不規(guī)則卷曲包圍［69］［圖6（a）］。Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶中活性位點(diǎn)由鐵離子、鹵化物、αKG 和兩個(gè)組氨酸殘基組成［71］，在Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶中鐵離子與鹵化物、αKG 和兩個(gè)組氨酸殘基形成配位作用（HXG），而在Fe/αKG 依賴(lài)型羥化酶中該鹵化物位置由來(lái)自天冬氨酸或谷氨酸的羧酸鹽配體取代（HXD/E）。

Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶在催化過(guò)程中表現(xiàn)出顯著的構(gòu)象變化。CurA 的晶體結(jié)構(gòu)在開(kāi)放和閉合構(gòu)象的不同配體狀態(tài)下被解析，在閉合構(gòu)象中Cap結(jié)構(gòu)域的27個(gè)殘基（A40～H66）覆蓋了由αKG結(jié)合引發(fā)的活性位點(diǎn)，之后在αKG 和氯化物作用下識(shí)別底物HMG-（S）-ACP 發(fā)生氯化作用。而在不存在αKG 情況下，CurA 處于開(kāi)放構(gòu)象并且Cap 結(jié)構(gòu)域完全無(wú)序［70］。在獨(dú) 立型Fe/αKG 依 賴(lài) 型鹵化酶WelO5結(jié)構(gòu)中觀察到類(lèi)似的構(gòu)象變化，WelO5在底物結(jié)合之前采用開(kāi)放構(gòu)象將活性位點(diǎn)暴露于溶劑中，底物結(jié)合后外部α-螺旋區(qū)域（W210～Q238）移動(dòng)覆蓋活性位點(diǎn)形成閉合構(gòu)象。并且WelO5晶體結(jié)構(gòu)的解析豐富了對(duì)動(dòng)態(tài)C末端α-螺旋區(qū)域的相關(guān)認(rèn)識(shí)，該基序?qū)τ讵?dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶底物識(shí)別至關(guān)重要［47］［圖6（b）］。WelO5 中的C 末端α-螺旋區(qū)域被重組或突變，使其在結(jié)構(gòu)上與AmbO5相似，構(gòu)建的WelO5-AmbO5 嵌合體與野生型AmbO5 底物范圍一樣寬泛［50］。在底物結(jié)合方面，對(duì)于載體蛋白依賴(lài)型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶，底物主要位于氯離子配體附近，而對(duì)于獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶，底物可以分別位于Fe（Ⅳ）＝O中間體氧結(jié)合位點(diǎn)的兩側(cè)［24］［圖6（c）］。

圖6 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的結(jié)構(gòu)特征Fig.6 Structural characteristics of Fe/αKG-dependent halogenases

3.2 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的催化機(jī)理

Fe/αKG 依賴(lài)型酶的非血紅素亞鐵離子與兩個(gè)組氨酸側(cè)鏈和αKG 的兩個(gè)氧原子形成4 個(gè)配位作用，在羥化酶中天冬氨酸或谷氨酸的側(cè)鏈羧酸部分與亞鐵離子形成第5個(gè)配位作用，而在鹵化酶中鹵素原子代替該位置形成第5個(gè)配位作用。在沒(méi)有底物時(shí)與水分子形成第6 個(gè)配位作用。Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶催化機(jī)制與Fe/αKG 依賴(lài)型加氧酶類(lèi)似［20-21，72］，通過(guò)形成高價(jià)態(tài)和短壽命的強(qiáng)氧化劑Fe（Ⅳ）＝O ferrel中間體（Ⅵ），底物結(jié)合后觸發(fā)亞鐵離子中心釋放水分子，隨后與氧氣分子結(jié)合引發(fā)催化作用，氧氣分子迅速與αKG 反應(yīng)形成琥珀酸鹽并釋放二氧化碳，從而形成高反應(yīng)性Fe（Ⅳ）＝O ferrel 中間體（Ⅵ）［73-75］。Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶基于自由基機(jī)制從底物未活化的碳?xì)滏I中攫取氫產(chǎn)生底物自由基和Fe（Ⅲ）-氯化物/羥基中間體（Ⅶ）。然后氯化物反彈到底物自由基生成鹵化產(chǎn)物，而在羥化酶中羥基發(fā)生反彈生成羥化產(chǎn)物［76］（圖7）。

圖7 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶和羥化酶的催化機(jī)理Fig.7 Catalytic mechanism of Fe/αKG-dependent halogenases and hydroxylases

4 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的應(yīng)用拓展

4.1 靈活引入鹵素

鹵化酶可以將不同鹵素原子（氟化物、氯化物、溴化物和碘化物）引入到各類(lèi)天然產(chǎn)物骨架中，在海洋天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的鹵化酶通常使用溴化物作為鹵素來(lái)源，而在陸生天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的鹵化酶主要使用氯化物［77-79］。氟元素在自然界鹵素存在范圍僅次于氯元素，但氟化天然產(chǎn)物較為罕見(jiàn)，可能由于氟的電負(fù)性較大而導(dǎo)致自然界氟化反應(yīng)較難實(shí)現(xiàn)［80］，碘元素在自然界鹵素存在豐度最低而較少存在于天然產(chǎn)物中。迄今為止表征的Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶主要與天然產(chǎn)物的氯化反應(yīng)有關(guān)，然而在含有過(guò)量NaBr的培養(yǎng)基中培養(yǎng)丁香假單胞菌時(shí)可以產(chǎn)生溴代丁香霉素E，此外當(dāng)用更高濃度的NaBr進(jìn)行檢測(cè)時(shí)SyrB2表現(xiàn)出溴化能力，但該酶對(duì)氯化物的底物偏好性為溴化物的180 倍［81］。CytC3 可以催化其天然底物L(fēng)-氨基丁酰-S-CytC2 發(fā)生溴化反應(yīng)［82］。HctB在用其天然底物和高濃度KBr測(cè)定時(shí)也表現(xiàn)出溴化活性［44］。此外對(duì)于獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶，WelO5也存在溴化活性可以生成（13R）-Br-12-epi-Fischerindole U［47，83］。HalB 可以催化L-賴(lài)氨酸發(fā)生溴化反應(yīng)［53］。但迄今為止還沒(méi)有報(bào)道過(guò)Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶催化碘元素或者氟元素的引入（圖8）。

圖8 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶催化的溴化反應(yīng)Fig.8 Bromination reactions catalyzed by Fe/αKG-dependent halogenases

除了在引入氯元素和溴元素方面的靈活性外，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶可以催化生物合成途徑中的多種氯化反應(yīng)。在Barbamide 生物合成途徑中BarB2 催化L-Leu-（S）-BarA 的一氯化和二氯化反應(yīng)，而B(niǎo)arB1催化氯化反應(yīng)生成（2S，4S）-5，5，5-3-Cl-Leu-（S）-BarA，證實(shí)了這兩種鹵化酶在生物合成中的協(xié)同性和必要性［41］。此外，CytC3 和HctB可以催化一氯化和二氯化反應(yīng)［43-44］。在未來(lái)研究中基于Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶引入鹵素的靈活性可以進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造以實(shí)現(xiàn)不同類(lèi)型和數(shù)量鹵素原子的引入。

4.2 拓展底物譜

大多數(shù)Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶與載體蛋白結(jié)合限制其作為生物催化劑的實(shí)際工業(yè)應(yīng)用，然而近年發(fā)現(xiàn)并鑒定的WelO5 在不需要載體蛋白的情況下催化鹵化反應(yīng)［47，84］，為Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶相關(guān)應(yīng)用開(kāi)辟了新的方向。通過(guò)對(duì)Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造可以進(jìn)一步拓寬其底物譜范圍［85-86］。許多課題組已經(jīng)嘗試通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造WelO5 以提高生物催化活性和擴(kuò)展底物范圍。Boal 課題組和Liu 課題組［50］合作通過(guò)分析WelO5 的結(jié)構(gòu)特征發(fā)現(xiàn)在催化過(guò)程中外部C 末端α-螺旋發(fā)生構(gòu)象變化并向底物活性位點(diǎn)移動(dòng)，對(duì)WelO5 和AmbO5 進(jìn)行序列比對(duì)分析推測(cè)C 末端α-螺旋區(qū)域的11 個(gè)殘基可能影響底物識(shí)別，由于該區(qū)域在WelO5 和AmbO5 靈活度較高，他們分別將WelO5 的N 末端與AmbO5 的C 末端結(jié)合構(gòu)建WelO5-AmbO5 嵌合體，和替換C 末端α-螺旋區(qū)域的18 個(gè)殘基構(gòu)建WelO5-AmbO5-18 嵌合體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種嵌合體底物范圍與AmbO5 一樣寬泛［圖9（a）］。

鑒于WelO5 的C 末端α-螺旋區(qū)域?qū)Φ孜锾禺愋缘挠绊?，Liu 課題組［48］進(jìn)一步鑒定和表征來(lái)源于Hapalosiphon weltwitschiiIC-52-3 的hapalosiphon生物堿鹵化酶WelO5*，該酶與WelO5 具有95%的序列一致性，僅有15 個(gè)氨基酸不同，其有11 個(gè)氨基酸位于C 末端的α-螺旋區(qū)域，結(jié)果表明WelO5*鹵化反應(yīng)活性比WelO5更高。

除了上述對(duì)WelO5 的C 末端區(qū)域進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造以外，Buller 課題組［87］通過(guò)分子對(duì)接確定關(guān)鍵位點(diǎn)并構(gòu)建WelO5*CA2和CB2兩種突變體用于在Martinelline 類(lèi)似物的兩個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)域選擇性鹵化反應(yīng)，標(biāo)志著首次將WelO5 家族酶應(yīng)用于非天然底物的鹵化反應(yīng)［圖9（b）］。

在進(jìn)一步擴(kuò)展獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶的底物范圍研究中，Hoebenreich 課題組［49］研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自Westiella intricataHT-29-1 的Wi-WelO15 能夠選擇性氯化非天然Hapalindoles 類(lèi)生物堿。以Wi-WelO15 突變體Wi-0（V6I/D284N）晶體結(jié)構(gòu)為起始結(jié)構(gòu)進(jìn)行4 輪定向進(jìn)化，最終突變體Wi-11（N47R/V81T/A82M/A88V/V90P/S93L/S103A）和Wi-12（N47R/A82L/V90P/S93D）對(duì)12-epi-Hapalindole C底物類(lèi)似物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)91%，化學(xué)選擇性高達(dá)96%［圖9（c）］。以上對(duì)WelO5 同源蛋白改造研究表明，獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶的底物譜主要取決于相關(guān)關(guān)鍵熱點(diǎn)殘基，未來(lái)研究可以將理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化相結(jié)合以豐富Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶的底物范圍。

圖9 獨(dú)立型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶底物譜的拓展Fig.9 Expansion of the substrate spectrum of non-carrier-dependent Fe/αKG-dependent halogenases

4.3 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶與羥化酶

Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶與羥化酶的活性位點(diǎn)的主要結(jié)構(gòu)差異在HXG 基序。在2014 年發(fā)現(xiàn)WelO5 之前，F(xiàn)e/αKG依賴(lài)型鹵化酶僅由載體依賴(lài)型Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶組成。因此，許多課題組嘗試將Fe/αKG依賴(lài)型羥化酶功能轉(zhuǎn)化為鹵化酶，由于羥化酶Asp/Glu羧酸鹽配體占據(jù)了鹵化物相應(yīng)鹵素原子位置與鐵離子形成配位作用，通常采取用甘氨酸或丙氨酸替換羥化酶HXD/E 基序的天冬氨酸或谷氨酸以重塑Fe/αKG 依賴(lài)型酶的二級(jí)配位球（second-coordination sphere）模擬鹵化酶的HXG基序［88］［圖10（a）］。但是將上述策略應(yīng)用于代表性Fe/αKG 依賴(lài)型羥化酶如?；撬犭p加氧酶（taurine dioxygenase，TauD）等的嘗試失敗了［89-90］。由此產(chǎn)生的突變體不僅沒(méi)有發(fā)揮鹵化酶的功能，而且失去其羥化酶活性，推測(cè)原因可能是TauD 突變體D101A 鐵結(jié)合效率低下，或者與活性位點(diǎn)中的氯離子結(jié)合能力不足。

通過(guò)采取同源二級(jí)配位球檢索策略，Boal課題組和Liu 課題組［91］合作利用WelO5 與其天然底物12-epi-Fischerindole U 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)以挖掘目標(biāo)羥化酶，來(lái)自伯克霍爾德氏菌Burkholderia ambifaria的Fe/αKG依賴(lài)型羥化酶SadA（天然底物N-琥珀酰-L-亮氨酸）與WelO5序列一致性?xún)H為19%，但兩者活性位點(diǎn)高度同源。作者首先嘗試用甘氨酸取代SadA 的HXD 基序中的天冬氨酸，突變體SadA D157G在NaCl或NaBr條件下鹵化其天然底物天然底物N-琥珀酰-L-亮氨酸的C3位，具有高區(qū)域選擇性但低鹵化/羥基化比率。鑒于WelO5突變體S189A發(fā)生羥基化作用，作者嘗試將SadA 中對(duì)應(yīng)殘基G179 突變?yōu)榻z氨酸以抑制其羥基化活性，但SadA D157G/G179S 的活性比D157G 更低并且化學(xué)選擇性保持不變，表明氧代中間體在野生型SadA 中與WelO5 中以不同方式穩(wěn)定，羥化酶HXD 基序中的單點(diǎn)突變可以轉(zhuǎn)換為鹵化活性［圖10（b）］。

此外，Buller 課題組通過(guò)對(duì)已知Fe/αKG 依賴(lài)型羥化酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，鑒定來(lái)源于細(xì)菌Sinorhizobium meliloti的脯氨酰4-羥化酶（L-prolinecis-4-hydroxylase，P4H）［92］，通過(guò)引入單點(diǎn)突變（D108G）將其重塑為鹵化酶，并且具有不同的區(qū)域選擇性。通過(guò)采取4輪定向進(jìn)化策略鑒定突變體SmP4H-7（V57L/S107T/D113E/T115P（off-target）/R274H），與親本酶SmP4H-0（D108G）相比，對(duì)L-脯氨酸的氯化活性提升了98 倍。此外，突變體SmP4H-7 展現(xiàn)出對(duì)鹵素原子引入的雜泛性，可以催化L-脯氨酸發(fā)生溴化反應(yīng)，但其更偏好氯離子［93］［圖10（c）］。以上將羥化酶重塑為新型鹵化生物催化劑豐富了碳?xì)滏I的功能化鹵化策略。

上述案例表明通過(guò)利用重塑Fe/αKG 依賴(lài)型羥化酶的二級(jí)配位球策略可以成功將其轉(zhuǎn)化為鹵化酶。除此之外，不同課題組嘗試?yán)蒙鲜霾呗詫Ⅺu化酶轉(zhuǎn)換為羥化酶，進(jìn)一步加深對(duì)催化雜泛性的認(rèn)識(shí)［88］。Drennan 課題組［42］試圖通過(guò)用Asp 或Glu 替換鹵化酶SyrB2 HXA 基序中的Ala 將其轉(zhuǎn)變?yōu)榱u化酶，然而鹵化酶活性消失并且沒(méi)有檢測(cè)到羥基化，即使該酶保留了其結(jié)合鐵的能力。除了鹵化物調(diào)節(jié)和配位對(duì)空間和靜電相互作用的要求外，通過(guò)計(jì)算方法對(duì)SyrB2反應(yīng)性的研究表明，鹵化反應(yīng)時(shí)底物位于Fe（Ⅳ）＝O中間體氧的遠(yuǎn)端并且靠近鹵化物有利于Fe（Ⅲ）-Cl反彈發(fā)生鹵化反應(yīng)，而非Fe（Ⅲ）-OH 反彈發(fā)生羥基化反應(yīng)［74，94-99］。這一假設(shè)通過(guò)使用非天然底物L(fēng)-正纈氨酸進(jìn)一步證實(shí)，L-正纈氨酸與天然底物L(fēng)-蘇氨酸相比含有額外的亞甲基，由于L-正纈氨酸含有較長(zhǎng)側(cè)鏈?zhǔn)蛊涓咏醮鶊F(tuán)，因此被SyrB2羥基化［100］，以上結(jié)果證實(shí)SyrB2可以氯化和羥基化不同的底物類(lèi)似物，并根據(jù)特定底物定位調(diào)節(jié)化學(xué)選擇性［圖10（d）］。

與SyrB2 不同的是，Boal 課題組和Liu 課題組合作［47］通過(guò)用天冬氨酸或谷氨酸成功地將WelO5轉(zhuǎn)化為羥化酶，突變體G166D 的晶體結(jié)構(gòu)顯示出在羥化酶中發(fā)現(xiàn)天冬氨酸與鐵離子產(chǎn)生配位作用，此外證明了二級(jí)配位球突變體S189A 產(chǎn)生了羥基化和鹵化產(chǎn)物的混合物，突出二級(jí)配位球氫鍵作用對(duì)化學(xué)選擇性調(diào)控的重要作用［圖10（e）］。

Buller課題組［87］通過(guò)以martinelline類(lèi)似物為底物篩選一組獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶（WelO5、AmbO5、 WelO5* 和 工 程 化 的SadA D157G），WelO5*主要生成羥基化產(chǎn)物（1%轉(zhuǎn)化為氯化產(chǎn)物，而40%轉(zhuǎn)化為羥基化產(chǎn)物）。為提高活性和化學(xué)選擇性，該課題組通過(guò)分子對(duì)接選取WelO5* 9 個(gè)殘基（N74、F77、V81、A82、I84、A88、V90、R153和I161）進(jìn)行單位點(diǎn)飽和突變，殘基A82、A88和R153的突變體文庫(kù)鹵化活性增加3～5倍，而殘基V81和I161的突變體文庫(kù)活性增加10～20倍。在篩選過(guò)程中，觀察到了另一種區(qū)域選擇性氯化產(chǎn)物。基于它們不同的區(qū)域選擇性，對(duì)來(lái)自第1輪進(jìn)化的最佳突變體CA1和CB1分別進(jìn)行迭代飽和突變。與CA1相比，第2輪突變體CA2（V181L/I161M）在氯化活性和羥基化區(qū)域選擇性方面進(jìn)一步提升了10倍，而第2輪變體CB2（V181R/I161S）幾乎完全催化底物氯化，并且CB2也可以催化溴化反應(yīng)，但其對(duì)溴化物的偏好低于氯化物［圖10（f）］。此外Hoebenreich課題組［49］發(fā)現(xiàn)Wi-WelO15 I84H 突變體可以催化羥基化反應(yīng)，進(jìn)一步證明化學(xué)選擇性受二級(jí)配位球中底物定位的控制［圖10（g）］。

圖10 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶和羥化酶功能互換實(shí)例（a）重塑Fe/αKG依賴(lài)型酶二級(jí)配位球的策略；（b）工程化改造羥化酶SadA催化鹵化反應(yīng)；（c）工程化改造羥化酶SmP4H催化鹵化反應(yīng)；（d）鹵化酶SyrB2分別催化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)；（e）工程化改造具有雜泛性的鹵化酶WelO5*分別區(qū)域選擇性催化羥化和鹵化反應(yīng)；（f）工程化改造鹵化酶WelO5催化羥化反應(yīng)；（g）工程化改造鹵化酶Wi-WelO15催化羥化反應(yīng)Fig.10 Function swap examples of Fe/αKG-dependent halogenases and hydroxylases(a)Strategies to reshape the second sphere region of Fe/αKG-dependent enzymes;(b)Engineering the hydroxylase SadA for halogenation;(c)Engineering the hydroxylase SmP4H for halogenation;(d)Halogenation reaction and hydroxylation catalyzed by halogenase SyrB2,respectively;(e)Engineering the promiscuous hydroxylase WelO5*for hydroxylation and halogenation,respectively;(f)Engineering the halogenase WelO5 for hydroxylation;(g)Engineering the halogenase Wi-WelO15 for hydroxylation.

類(lèi)似地，Chang 課題組［53］解析BesD 與底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)除了HXG 基序外，殘基His134 和Asn219 分別通過(guò)與底物和氧配體的二級(jí)配位球相互作用，對(duì)化學(xué)選擇性產(chǎn)生重要影響。在未來(lái)研究中可以通過(guò)結(jié)合理論計(jì)算結(jié)果重塑Fe/αKG 依賴(lài)型酶的二級(jí)配位球［101-102］，鑒定區(qū)域選擇性關(guān)鍵殘基以實(shí)現(xiàn)定制化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)。

4.4 建立新反應(yīng)類(lèi)型

Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶不僅可以催化碳鹵鍵的形成，而且能催化碳氮鍵的形成，例如野生型SyrB2催化脂肪族底物發(fā)生疊氮化和硝化反應(yīng)［103］。SaDAH 也表現(xiàn)出對(duì)（?）-acutumine 的疊氮化催化活性［52］。氨基酸鹵化酶HalB 可以識(shí)別疊氮陰離子生成疊氮賴(lài)氨酸［53］（圖11）。由HalB 和HalA 催化產(chǎn)生的氯代賴(lài)氨酸可以通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)生成含9個(gè)氨基酸的短肽，體現(xiàn)出Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶在利用合成生物學(xué)策略生產(chǎn)天然產(chǎn)物類(lèi)似物的潛能。并且新反應(yīng)類(lèi)型疊氮化和硝化反應(yīng)為脂肪族底物碳?xì)滏I活化形成碳氮鍵提供了新的生物催化途徑。

圖11 Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的新反應(yīng)類(lèi)型Fig.11 Novel reaction type of Fe/αKG-dependent halogenases

5 總結(jié)與展望

不對(duì)稱(chēng)鹵化sp3雜化碳中心具有重要研究意義，形成的碳鹵鍵可用于有機(jī)合成后期功能化反應(yīng)。自然界通過(guò)進(jìn)化利用Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶催化脂肪族底物不對(duì)稱(chēng)鹵化反應(yīng)，在過(guò)去10 多年關(guān)于Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的研究中對(duì)天然產(chǎn)物生物合成途徑進(jìn)行解析不斷有載體依賴(lài)型和獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在功能更新方面，鹵素原子的引入可以增強(qiáng)化合物分子的抗癌、抗真菌、抗病毒、抗炎等生物活性［104］，例如抗真菌化合物丁香霉素E中氯原子的引入可以將其抗真菌活性提高4倍［105］，碳鹵鍵可以與靶標(biāo)蛋白形成的鹵鍵相互作用而影響相關(guān)活性，在藥物設(shè)計(jì)中引入鹵素原子從而改善相關(guān)化合物的成藥性［106］。此外通過(guò)生物合成途徑形成的隱秘的碳鹵鍵可以用于構(gòu)筑環(huán)丙烷合成砌塊和用于合成氨基酸中末端炔基等，類(lèi)似地，以碳鹵鍵作為重要中間體將Fe/αKG 依賴(lài)型氨基酸鹵化酶與后修飾酶進(jìn)行級(jí)聯(lián)可以合成含氮雜環(huán)、二胺、酮酸和肽類(lèi)等不同類(lèi)型產(chǎn)物［53］，并且載體依賴(lài)型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶也可以鹵化氨基酸類(lèi)底物，突出Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶在合成生物學(xué)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的應(yīng)用潛力。與其他類(lèi)型的鹵化酶相比，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶采取獨(dú)特的自由基機(jī)制區(qū)域和立體選擇性鹵化脂肪族底物，但目前其底物范圍、催化活性等方面有待進(jìn)一步提升，在未來(lái)研究中可以從以下5方面開(kāi)展：

（1）新酶的挖掘與表征。WelO5 和BesD 等的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索新的獨(dú)立型Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶提供重要參考，未來(lái)可以利用生物信息學(xué)方法以已知鹵化酶基因作為模板并結(jié)合關(guān)鍵特征殘基從宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘篩選進(jìn)而獲得新的Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶［107］。

（2）酶催化活性的提升。Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶的低周轉(zhuǎn)數(shù)限制其工業(yè)應(yīng)用，目前主要采取在反應(yīng)體系中添加抗氧化劑的策略［108］。未來(lái)研究中可以通過(guò)采取類(lèi)似P450為提高周轉(zhuǎn)數(shù)的定向進(jìn)化方法對(duì)Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶進(jìn)行工程化改造以提升其催化活性。

（3）酶區(qū)域選擇性的控制。WelO5* CA2 和CB2 兩種突變體區(qū)域選擇性催化martinelline 發(fā)生鹵化反應(yīng)［87］，此外羥化酶SmP4H 可以區(qū)域選擇性分別催化羥化反應(yīng)和鹵化反應(yīng)［93］。未來(lái)可以進(jìn)一步基于進(jìn)化視角從酶的結(jié)構(gòu)-功能角度出發(fā)鑒定調(diào)控區(qū)域選擇性的關(guān)鍵殘基以研究區(qū)域選擇性機(jī)制，并有利于拓展底物范圍［109］。

（4）酶反應(yīng)類(lèi)型的拓展。鑒于Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶和羥化酶兩種酶家族活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)高度相似，目前已有研究對(duì)羥化酶如SmP4H 進(jìn)行改造使其具有羥化反應(yīng)活性，對(duì)鹵化酶如WelO5進(jìn)行改造使其具有羥化反應(yīng)活性。未來(lái)對(duì)Fe/αKG 依賴(lài)型酶的二級(jí)配位球進(jìn)行重塑以實(shí)現(xiàn)定制化鹵化反應(yīng)和羥化反應(yīng)［88］。此外與Fe/αKG 依賴(lài)型羥化酶類(lèi)似［110］，F(xiàn)e/αKG 依賴(lài)型鹵化酶可以催化疊氮化和硝化反應(yīng)形成碳氮鍵［103］，豐富碳氮鍵形成的酶工具箱。

（5）人工生物合成途徑的創(chuàng)建。展望未來(lái)，將Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶引入人工生物合成途徑并結(jié)合代謝工程策略可以多樣性高效合成人工天然產(chǎn)物化合物庫(kù)。此外在未來(lái)通過(guò)模擬Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶催化機(jī)制可以設(shè)計(jì)人工酶和仿生化學(xué)催化劑等［111-113］，與其他生物合成酶進(jìn)行適配創(chuàng)建全新的人工生物合成途徑［114-116］。

綜上所述，隨著近年來(lái)Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶相關(guān)研究的不斷深入，其反應(yīng)類(lèi)型、底物范圍和選擇性等不斷擴(kuò)展。大自然是世界上最強(qiáng)大的化學(xué)家，通過(guò)解析天然產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶可以豐富Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶類(lèi)型。除此之外，未來(lái)蛋白質(zhì)工程策略和機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)合將進(jìn)一步拓展Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶的生物催化范圍。將Fe/αKG 依賴(lài)型鹵化酶發(fā)展為高效的生物催化劑并利用生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)或化學(xué)酶法催化策略可以實(shí)現(xiàn)未經(jīng)活化sp3雜化碳中心的選擇性鹵化反應(yīng)，為合成生物學(xué)發(fā)展提供關(guān)鍵酶學(xué)催化元件（圖12）。

圖12 合成生物學(xué)理念指導(dǎo)下的Fe/αKG依賴(lài)型鹵化酶工程化改造并整合至微生物細(xì)胞工廠Fig.12 Engineering of Fe/αKG-dependent halogenases and their adaption in microbial chemical factories under the guidance of the theory of synthetic biology