Caulobacter crescentus 蔗糖水解酶受體亞位點(diǎn)分子改造及其在松二糖制備中的應(yīng)用

王蕾，邢晨晨，郭志勇，宿玲恰，吳敬

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

松二糖是蜂蜜寡糖的主要成分之一，是由1分子葡萄糖和1 分子果糖以α-1，3 糖苷鍵連接而成的還原性二糖［1-2］。松二糖是蔗糖的同分異構(gòu)體，其甜度為蔗糖的50%，甜味和蔗糖相似。由于松二糖不易被人體生物酶利用，因此具有非致齲齒性和低熱量的優(yōu)點(diǎn)。此外，松二糖還可控制脂肪積累［3］，適合肥胖癥、糖尿病、高脂血癥和高血壓等患者食用，有望代替蔗糖成為新型功能性甜味劑［4-5］。

目前，松二糖主要由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶或淀粉蔗糖酶催化制備［5］。已有研究表明，Bacillus stearothermophilus、Bacillus macerans和Bacillus circulans來源的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可用于制備松二糖，但產(chǎn)率低于45%，并且含副產(chǎn)物海藻酮糖，同時(shí)產(chǎn)物中還存在糖基化的松二糖［6］，需要經(jīng)過糖化酶處理，因此不適合工業(yè)化生產(chǎn)。而選用淀粉蔗糖酶制備松二糖產(chǎn)率高，受到青睞［5，7］。

淀粉蔗糖酶是一種多功能酶，可催化轉(zhuǎn)苷反應(yīng)和水解反應(yīng)。其中，轉(zhuǎn)苷反應(yīng)是其主反應(yīng)，包含分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)和聚合反應(yīng)，分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)又稱異構(gòu)反應(yīng)（圖1）。淀粉蔗糖酶能夠通過異構(gòu)反應(yīng)轉(zhuǎn)化蔗糖制備松二糖［8］。Wang 等［9］使用Neisseria polysaccharea來源的淀粉蔗糖酶制備松二糖，當(dāng)蔗糖濃度為2.5 mol/L 時(shí)，松二糖產(chǎn)率可達(dá)56%。宿玲恰等［10］構(gòu)建了N.polysaccharea來源的淀粉蔗糖酶突變體G396S，并在食品級菌株枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)，以2 mol/L 的蔗糖為底物時(shí)，松二糖產(chǎn)率可達(dá)61.7%，產(chǎn)量為410 g/L。盡管采用淀粉蔗糖酶制備松二糖的產(chǎn)率高，但存在副產(chǎn)物麥芽寡糖和海藻酮糖［11-12］，不利于后續(xù)分離提取。目前，N.polysaccharea來源的淀粉蔗糖酶制備松二糖時(shí)，海藻酮糖與松二糖比例最低為0.12或0.21（2%/17%［13］或3%/14%［14］），在反應(yīng)過程中添加果糖，只能顯著降低麥芽寡糖，對海藻酮糖的降低無顯著效果［3，11］。

圖1 淀粉蔗糖酶催化的反應(yīng)類型Fig.1 Reactions catalyzed by amylosucrase

蔗糖水解酶和淀粉蔗糖酶同屬于糖苷水解酶GH13 家族的第4 亞家族，序列一致性在30%～55%之間［15-16］。與淀粉蔗糖酶催化功能相反，蔗糖水解酶可催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，轉(zhuǎn)苷反應(yīng)微弱［17］。本實(shí)驗(yàn)室前期通過機(jī)器學(xué)習(xí)、序列結(jié)構(gòu)分析、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以及QM/MM MD 模擬揭示了決定該家族轉(zhuǎn)苷/水解特征的機(jī)制，并且獲得了Caulobacter crescentus來源的蔗糖水解酶突變體S271A，其具有和淀粉蔗糖酶相似的轉(zhuǎn)苷能力，制備松二糖產(chǎn)率可達(dá)55.9%，副產(chǎn)物海藻酮糖產(chǎn)率為9.1%，并且不含副產(chǎn)物麥芽寡糖［18］。因此，本研究以S271A 為出發(fā)酶，通過蛋白結(jié)構(gòu)分析和分子改造獲得反應(yīng)特異性提升的突變體，并進(jìn)一步對其制備松二糖的條件進(jìn)行優(yōu)化，提高松二糖的產(chǎn)量和純度，為工業(yè)化制備松二糖奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。本研究還對突變體進(jìn)行了分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，為松二糖高效制備酶學(xué)機(jī)制提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

克隆宿主Escherichia coliJM109 和表達(dá)宿主E.coliBL21（DE3）購自上海生工生物公司并由本實(shí)驗(yàn)室保藏，帶有S271A 基因的質(zhì)粒pET-24a（+）-ccsh S271A由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 主要試劑及儀器

試劑：DNA 聚合酶2×Phanta Max Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司；卡那霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉購自英國Oxiod；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團(tuán)；質(zhì)粒測序與引物合成由天霖（無錫）生物科技有限公司完成。

儀器：PTC-200 型核酸擴(kuò)增儀購自美國MJ Research；DYY-6C 型核酸電泳儀購自北京六一電泳儀廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海醫(yī)療器械研究所；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad 公司；UV-1700 紫外可見光分光光度計(jì)購自日本Shimadzu 公司；Agilent 1200 高效液相色譜系統(tǒng)購自美國Agilent 公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 突變體的構(gòu)建與表達(dá)

1.2.1 突變體的構(gòu)建

以質(zhì)粒pET-24a（+）-ccsh S271A 為模板，對第382位點(diǎn)、第211位點(diǎn)、第273位點(diǎn)和第209位點(diǎn)進(jìn)行突變。根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表1），采用DNA 聚合酶2 × Phanta Max Master Mix 進(jìn)行一步PCR，將PCR 產(chǎn)物經(jīng)過Dpn Ⅰ除去模板后轉(zhuǎn)入E.coliJM109，并涂布于含有Kan 抗性的LB 固體平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)8 h，提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證，獲得帶有各突變體S271A/I382G、S271A/I382S、S271A/I382T、S271A/I382Q、S271A/I382K、S271A/I382R、S271A/V211I、S271A/P273A、S271A/P273S 和S271A/P209R基因的質(zhì)粒。

表1 定點(diǎn)突變引物Tab.1 Primers used for the site-directed mutation

1.2.2 突變體的表達(dá)

將含各突變體基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21（DE3）中，并涂布于含有Kan抗性的LB 固體平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至含有Kan 抗性的液體LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)8 h。將種子液按照5%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL 含有Kan 抗性的TB 培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)2 h。加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG，于25 ℃、200 r/min 搖床中培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，于4 ℃、8000 r/min離心機(jī)中收集菌體，用50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4（pH 7.0）重懸菌體至OD600為50 后進(jìn)行高壓勻漿破壁，4 ℃、8000 r/min 進(jìn)行離心后收集上清液，并采用硫酸銨沉淀進(jìn)行濃縮，在酶液中加入0.3 kg/L 的硫酸銨粉末，并攪拌溶解，在4 ℃冰箱中放置過夜，然后離心棄上清收集沉淀。用10 mmol/L 的pH 7.0 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸沉淀直至溶解，然后放入透析袋中于4 ℃冰箱過夜透析，在4 ℃，8000 r/min 的離心機(jī)中離心20 min后收集上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 突變體的純化

由于重組酶的蛋白末端已經(jīng)帶有His-Tag，所以用鎳親和色譜柱His-TrapTM HP-5 mL 對收集的酶液進(jìn)行純化。

結(jié)合緩沖液（A 液）成分：25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，調(diào)節(jié)pH 至7.0。洗脫緩沖液（B 液）成分：300 mmol/L 咪唑，25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，調(diào)節(jié)pH至7.0。

先用100 mL的A液將鎳親和色譜柱進(jìn)行平衡，接著將待純化的粗酶液進(jìn)行上樣。上樣結(jié)束后，用100 mL 的A 液進(jìn)行沖洗，沖洗結(jié)束后，分別用100 mL 的5% B 液-95% A 液 混 合 液、10% B 液-90% A 液混合液、15% B 液-85% A 液混合液、100% B 液依次進(jìn)行沖洗，收集洗脫液進(jìn)行酶活和蛋白含量檢測。

1.3 突變體的分析

1.3.1 酶活檢測

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定酶活：將1.9 mL 0.3 mol/L 的蔗糖溶液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 7.0）在30 ℃預(yù)熱后，加入0.1 mL 適當(dāng)稀釋的酶液并混勻，30 ℃反應(yīng)10 min后，加入3 mL DNS 溶液終止反應(yīng)。然后將反應(yīng)液在100 ℃水浴中煮沸7 min，迅速放在冰水中進(jìn)行冷卻，最后加入10 mL 蒸餾水定容到15 mL，在540 nm 處測定光密度。檢測不同pH 下的酶活時(shí)，用不同pH 的K2HPO4-KH2PO4緩 沖液（5.0、6.0、6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0） 和 不 同pH 的Na2CO3-NaHCO3緩沖液（9.0、10.0、11.0）配制底物。一個(gè)酶活單位（U）定義為：在上述條件下每分鐘催化產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol還原糖所需的酶量［10］。

1.3.2 松二糖酶轉(zhuǎn)化工藝

用pH 7.0 緩沖液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4）配制濃度為2.5 mol/L 的蔗糖母液，按反應(yīng)體系10 mL加蔗糖母液8.0 mL和酶液，不足部分用緩沖液補(bǔ)齊。突變體分析時(shí)，按3.5 mg/mL 加酶（通過粗蛋白含量和蛋白電泳灰度積分計(jì)算目的蛋白含量），緩沖液補(bǔ)齊到10 mL，溫度30 ℃，pH 7.0，反應(yīng)48 h。

雙突變S271A/I382Q 加酶量對酶轉(zhuǎn)化的影響：蔗糖母液8 mL，酶液按20 U/mL、40 U/mL、60 U/mL、80 U/mL、100 U/mL 分別加酶，加緩沖液補(bǔ)齊到10 mL，溫度30 ℃，pH 7.0，反應(yīng)48 h。

反應(yīng)溫度對酶轉(zhuǎn)化的影響：蔗糖母液8 mL，酶液按60 U/mL 加酶，選擇不同反應(yīng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃），加緩沖液補(bǔ)齊到10 mL，pH 7.0，反應(yīng)48 h。

反應(yīng)pH 對酶轉(zhuǎn)化的影響：用不同pH 的K2HPO4-KH2PO4緩沖液（5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）和不同pH 的Na2CO3-NaHCO3緩沖液（9.0、10.0、11.0）配制蔗糖母液，蔗糖母液8 mL，酶液按60 U/mL 加酶，加相應(yīng)pH 緩沖液補(bǔ)齊到10 mL，溫度30 ℃，反應(yīng)48 h。

蔗糖濃度對酶轉(zhuǎn)化的影響：用pH 5.0 緩沖液（50 mmol/L K2HPO4-KH2PO4）配制濃度為2.75 mol/L的蔗糖母液，按反應(yīng)體系10 mL加蔗糖母液（控制終濃度1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）和酶液，加緩沖液補(bǔ)齊到10 mL，溫度30 ℃，反應(yīng)48 h。酶反應(yīng)結(jié)束后，在沸水中煮沸10 min 滅活，用HPLC檢測松二糖生成量。

1.3.2 HPLC分析檢測產(chǎn)物

將酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)物以12000 r/min 離心10 min后取上清，用水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后與乙腈按照1∶1 的比例進(jìn)行混合，在4 ℃冰箱放置8 h 后離心取上清，用0.22 μm 的濾頭進(jìn)行過濾。采用HPLC 進(jìn)行檢測分析，檢測條件為：Agilent 1200 HPLC 色譜儀，示差折光檢測器（RID），色譜柱為Syncronis Amino Column 4.6 mm × 250 mm（5 μm），流動(dòng)相為80%乙腈（體積分?jǐn)?shù)）和水的混合液，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃。松二糖產(chǎn)率公式：

1.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

首先利用SWISS-MODEL 網(wǎng)站［19］對S271A 和S271A/I382Q 突變體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。利用GaussianView 軟件生成配體松二糖或海藻酮糖結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行QM/MM優(yōu)化，計(jì)算獲得配體電荷。然后利用LeDock 軟件［20］按照分子對接的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行分子對接。最后獲得S271A和S271A/I382Q與松二糖復(fù)合物。使用PROPKA3［21］方法對可解離殘基（Asp、Glu 和His）的質(zhì)子化狀態(tài)進(jìn)行分配?；谏弦徊将@得的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。采用Amber ff14SB［22］和GLYCAM_06j［23］力場來分別描述蛋白和碳水化合物。首先將復(fù)合物結(jié)構(gòu)沉浸在TIP3P［24］水盒子里，且水盒子邊緣距離蛋白表面的最小距離是1.6 nm。然后加入適量的鈉離子以平衡系統(tǒng)電荷。體系先在NVT 系綜緩慢升溫到300 K，接著在NPT 系綜平衡2 ns 從而使體系的壓力密度穩(wěn)定，最后進(jìn)行50 ns MD 模擬。所有MD 模擬均通過Amber 18 GPU 版本進(jìn)行。積分步長為2 fs，用SHAKE算法［25］來約束所有的共價(jià)鍵。長程靜電相互作用通過Particle Mesh Ewald（PME）［26］計(jì)算，非鍵相互作用的截?cái)喟霃綖?.2 nm。軌跡分析通過VMD［27］和AmberTools19的標(biāo)準(zhǔn)模塊［28］進(jìn)行。

3D結(jié)構(gòu)可視化圖片的制作軟件選用PyMOL軟件，數(shù)據(jù)分析圖片選用Origin軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點(diǎn)的選擇與設(shè)計(jì)

以與S271A序列一致性為41.21%的Xanthomonas axonopodis蔗糖水解酶（XaSH）為模板（PDB 編號為3CZK）［17］，采用SWISS-MODEL 對S271A 進(jìn)行同源建模［圖2（a）］，QMEAN 和GMQE 打分結(jié)果分別為-2.38（高于-4）和0.76（接近1），表明模擬結(jié)構(gòu)可靠［29-31］。通過LeDock 程序?qū)⑺啥菍拥絊271A 的活性口袋，對其果糖結(jié)合區(qū)域的位點(diǎn)進(jìn)行分析［圖2（b）］。同時(shí)與同家族淀粉蔗糖酶進(jìn)行多重序列比對［圖2（c）］。蛋白結(jié)構(gòu)3CZK確定了XaSH 的-1 和+1 亞位點(diǎn)［17］，同時(shí)蛋白結(jié)構(gòu)1MW0 確 定 了NpAS 的-1、+1、+2、…、+5 位點(diǎn)［32］。其中，-1 亞位點(diǎn)是底物蔗糖結(jié)合時(shí)葡萄糖單元的結(jié)合位點(diǎn)，也是聚合反應(yīng)時(shí)底物糖單元延長的位點(diǎn)；+1 亞位點(diǎn)是底物蔗糖結(jié)合時(shí)果糖單元的結(jié)合位點(diǎn)，也是聚合反應(yīng)時(shí)葡萄糖的結(jié)合位點(diǎn)；+2、…、+5 亞位點(diǎn)是聚合反應(yīng)時(shí)麥芽寡糖的結(jié)合位點(diǎn)。通過分析對比，可確定CcSH S271A的-1、+1、+2 等亞位點(diǎn)，在CcSH S271A 中處于+1 亞位點(diǎn)但不保守的氨基酸為I209、V211、P273 和I382。為了探究S271A 與淀粉蔗糖酶的位點(diǎn)差異對松二糖合成的影響，將I209、V211、P273 和I382 分別突變成淀粉蔗糖酶中對應(yīng)氨基酸，即設(shè)計(jì)突變體I209R、V211I、P273A 和I382G，同時(shí)為了在P273 位點(diǎn)引入可能的氫鍵設(shè)計(jì)突變體P273S。此外，在所有淀粉蔗糖酶和蔗糖水解酶中，除了在382 位點(diǎn)處為I 外，其他酶在該位點(diǎn)處均為無側(cè)鏈的G，這可為+2 亞位點(diǎn)糖單元的結(jié)合提供空間以利于生成高聚合度麥芽寡糖或直鏈淀粉（PDB 編號1MW0）［32］。I382 形成的空間位阻破壞了+2 亞位點(diǎn)糖的結(jié)合，這也是具有轉(zhuǎn)苷活性的S271A 不產(chǎn)生高聚合度產(chǎn)物的可能原因。針對這一特征，設(shè)計(jì)突變體I382S、I382T、I382Q、I382K 和I382R，以在保留空間位阻的同時(shí)，引入不同鏈長的極性氨基酸，可能為+1 亞位點(diǎn)果糖單元的結(jié)合提供氫鍵相互作用。

圖2 結(jié)構(gòu)模擬與序列比對分析Fig.2 Structure simulations and sequence alignment analysis

2.2 突變體的構(gòu)建與重組表達(dá)

以質(zhì)粒pET-24a（+）-ccsh S271A 為模板，通過PCR 獲得上述10 個(gè)突變體基因，并在E.coliBL21（DE3）中重組表達(dá)。取樣測發(fā)酵液菌濃OD600，同時(shí)離心收集1 mL 菌體，破壁后取上清測定酶活，結(jié)果如圖3 所示，所有表達(dá)突變體的菌株，除S271A/I382R、S271A/V211I 表達(dá)宿主菌濃明顯高于S271A 外，其余差別不大。所有突變體發(fā)酵液酶活均出現(xiàn)不同程度的下降，其中S271A/I382G、S271A/I382T和S271A/I382Q酶活分別為11.9 U/mL、11.8 U/mL、11.2 U/mL，為單突變體S271A 酶活的80%以上；而其他突變體發(fā)酵酶活受到較大影響，特 別 是 S271A/I382K、 S271A/I382R、 S271A/P273S 和S271A/I209R 的酶活下降至單突變體S271A的20%以下。

圖3 突變體搖瓶發(fā)酵情況Fig.3 The shake flask fermentation of E.coli BL21(DE3)mutants

2.3 突變體制備松二糖性能表征

制備松二糖時(shí)，以2 mol/L 蔗糖為底物，按目的酶量3.5 mg/mL 加量加入S271A 和各突變體，在pH 7.0、30 ℃條件下反應(yīng)48 h。結(jié)果如圖4 所示，僅突變體S271A/I382Q 制備松二糖的產(chǎn)率提高，達(dá)到60.2%，松二糖的濃度為408.7 g/L。同時(shí)，副產(chǎn)物海藻酮糖的產(chǎn)率比S271A（9.1%）顯著降低，僅為2.3%，此時(shí)海藻酮糖和松二糖比例為0.04（2.3%/60.2%），顯著低于S271A 的0.16（9.1%/55.9%）及N.polysaccharea淀粉蔗糖酶的0.12［13］（或0.21［14］），有利于松二糖后續(xù)分離及純化。因此，選擇突變體S271A/I382Q 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖4 突變體制備松二糖的HPLC結(jié)果分析Fig.4 HPLC analysis of turanose produced from sucrose by the mutants

2.4 突變體S271A/I382Q的純化

為了考察雙突變體S271A/I382Q的酶學(xué)性質(zhì)以及工業(yè)化應(yīng)用潛力，同時(shí)與單突變體S271A酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行對比，本研究對S271A/I382Q 進(jìn)行了純化，經(jīng)鎳柱親和色譜，達(dá)到獲得電泳純（圖5），比活為11.5 U/mg（表2），與S271A比活（13.1 U/mg）［18］較為接近。

表2 S271A/I382Q純化過程參數(shù)Tab.2 Parameter for S271A/I382Q purification

2.5 突變體S271A/I382Q的酶學(xué)性質(zhì)

以蔗糖為底物測得S271A/I382Q 的Km為1.5 mmol/L，比S271A 的Km（4.2 mmol/L）［18］顯著降低，說明S271A/I382Q 與底物蔗糖的親和力更好。kcat為14.8 s?1，較單突變體略有降低。kcat/Km為9.8 mmol/（L·s），是S271A 的1.96 倍［18］，催化效率顯著提高。

為了探究S271A/I382Q 的最適反應(yīng)溫度，在20～50 ℃的條件下測定酶活。如圖6（a）所示，S271A/I382Q 的酶活隨著溫度的升高而先上升再下降，最適溫度為45 ℃，和S271A 相同［18］。將其置于30 ℃，每隔24 h 定時(shí)取樣測定殘留酶活。結(jié)果顯示，S271A/I382Q 的半衰期為384 h［圖6（b）］，比S271A 的 半 衰 期 長72 h［18］，說 明 將S271A 第382 位點(diǎn)突變?yōu)楣劝滨０窌?huì)提高酶的熱穩(wěn)定性，更有利于工業(yè)化應(yīng)用，S271A/I382Q 穩(wěn)定性的增加，可能是游離酶或382Q 不與受體位點(diǎn)果糖形成氫鍵時(shí)，382Q的側(cè)鏈與鄰近催化三聯(lián)體的D380形成氫鍵（圖7），有利于穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。

圖7 突變體271A/I382Q中Q382和D380的氫鍵相互作用Fig.7 Hydrogen bond developed between Q382 and D380 in the mutant S271A/I382Q

為了探究S271A/I382Q的最適pH，在pH 5.0～11.0 條件下測定酶活。如圖6（c）所示，S271A/I382Q 的最適pH 為8.0，pH 在6.5～8.5 的范圍內(nèi)，相對酶活均在85%以上，超過該pH 范圍時(shí)，酶活驟降，但在pH 6.5 以下，較S271A 下降緩慢。為了探究S271A/I382Q 在不同pH 下的穩(wěn)定性，將上述酶液在pH 5.0～9.0、30 ℃保溫48 h后測定酶活。結(jié)果表明，S271A/I382Q 在pH 6.0～7.0 范圍內(nèi)較穩(wěn)定，相對酶活均在90%以上，最穩(wěn)定pH 為6.0，低于S271A 的最穩(wěn)定pH 8.0［18］，而在偏堿或偏酸的條件下穩(wěn)定性較差［圖6（d）］。

2.6 突變體S271A/I382Q制備松二糖條件優(yōu)化

為了進(jìn)一步提高雙突變體S271A/I382Q制備松二糖的產(chǎn)率以及探究酶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化對產(chǎn)物中松二糖純度的影響，將酶轉(zhuǎn)化條件中的加酶量、反應(yīng)溫度、初始pH 和蔗糖濃度進(jìn)行優(yōu)化。首先以2.0 mol/L 蔗糖溶液為底物，在pH 7.0 和30 ℃條件下，反應(yīng)48 h，考察了不同加酶量（20～100 U/mL）對松二糖制備的影響。結(jié)果如圖8（a）所示，當(dāng)S271A/I382Q的加酶量由20 U/mL增加到為40 U/mL時(shí)，松二糖的產(chǎn)率從53.1%升高到57.4%，繼續(xù)增加酶量，松二糖產(chǎn)率逐漸下降，表明過多的酶液并不利于松二糖的制備，最適加酶量為40 U/mL。

為了探究S271A/I382Q制備松二糖時(shí)的最優(yōu)溫度，本研究以2.0 mol/L 蔗糖溶液為底物，加入40 U/mL 的S271A/I382Q，在pH 7.0、20～50 ℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為48 h。松二糖產(chǎn)率如圖8（b）所示，當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，松二糖的產(chǎn)率達(dá)到最高，為57.4%，與S271A 制備松二糖的最適溫度一致［18］。

在上述加酶量和溫度優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對反應(yīng)pH 進(jìn)行優(yōu)化。以2.0 mol/L 蔗糖溶液為底物，考察pH 3.0～10.0 對松二糖制備的影響。結(jié)果如圖8（c）所示，pH 5.0～8.0 有利于松二糖制備，其中當(dāng)pH 為5.0 時(shí)，松二糖產(chǎn)率最高，達(dá)到70.3%；當(dāng)pH 低于5.0 或高于8.0 時(shí)松二糖產(chǎn)率顯著下降至32%以下。和S271A 制備松二糖相比，最適pH 由8.0 降為5.0，可能由于在催化三聯(lián)體附近引入了極性氨基酸并與之形成氫鍵（圖7），改變了催化三聯(lián)體氨基酸的解離平衡［33-34］。

圖8 S271A/I382Q催化制備松二糖的條件優(yōu)化Fig.8 Optimization of reaction conditions for the catalysis of S271A/I382Q to produce turanose

本研究還優(yōu)化了S271A/I382Q制備松二糖的底物濃度，以1.0～2.5 mol/L 的蔗糖溶液為底物，S271A/I382Q 的加量按照底物濃度設(shè)定為20～50 U/mL，并在30 ℃、pH 5.0 的條件下催化反應(yīng)48 h。結(jié)果如圖8（d）所示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.0 mol/L 時(shí)，松二糖產(chǎn)率達(dá)到最高，為70.3%，此時(shí)產(chǎn)物中松二糖的濃度為480 g/L。

通過上述S271A/I382Q 制備松二糖的工藝優(yōu)化，確定了最適的酶轉(zhuǎn)化條件。在pH 5.0、溫度30 ℃的條件下，以2 mol/L 的蔗糖溶液為底物，添加40 U/mL 的S271A/I382Q，反應(yīng)48 h，松二糖的產(chǎn)率最高（為70.3%），此時(shí)產(chǎn)物中松二糖的濃度為480 g/L，在此條件下制備的產(chǎn)物中未檢測出海藻酮糖。該產(chǎn)率高于現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道N.polysaccharea淀粉蔗糖酶（56%）［9］、N.polysaccharea淀粉蔗糖酶突變體G396S（61.7%）［10］，以及C.crescentus蔗糖水解酶突變體S271A（66.3%）的松二糖產(chǎn)率［18］，同時(shí)也高于添加果糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的N.polysaccharea淀粉蔗糖酶（61.6%）［3］及其突變體G396S（67.6%）［10］的松二糖產(chǎn)率（松二糖對總底物產(chǎn)率）。更為重要的是，S271A/I382Q經(jīng)過工藝條件優(yōu)化，不產(chǎn)副產(chǎn)物海藻酮糖。

2.7 分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

從上述酶轉(zhuǎn)化研究可以看出，S271A/I382Q 相對于單突變體S271A 不僅提高了松二糖（α-1，3 鍵）的產(chǎn)率，而且極大降低了副產(chǎn)物海藻酮糖（α-1，1 鍵）的生成量（圖4），表明S271A/I382Q更傾向于催化α-1，3鍵合成。S271A/I382Q更傾向于催化α-1，3 鍵合成，原因可能是對于不同突變體而言，果糖在參與形成糖苷鍵時(shí)的構(gòu)象的偏好性不同。為了驗(yàn)證該猜測，分別對S271A和S271A/I382Q與松二糖和海藻酮糖進(jìn)行了分子對接，并在對接的基礎(chǔ)上進(jìn)行了50 ns的MD模擬以檢測果糖在受體位點(diǎn)的相互作用情況。蛋白骨架的RMSD值隨時(shí)間演變的結(jié)果如圖9（a）、（b）所示，體系均在10 ns后達(dá)到平衡。隨后對MD模擬的軌跡進(jìn)行了分析（圖10）。

圖9 CcSH突變體蛋白骨架原子的均方根偏差（RMSD） 隨時(shí)間演變過程Fig.9 Time evolution for the root-mean-square deviation(RMSD)of the backbone atoms of CcSH mutants

在單突變體S271A 中，當(dāng)果糖3號位羥基靠近葡萄糖形成α-1，3糖苷鍵（松二糖）時(shí)，I382與I314構(gòu)成的疏水簇與糖環(huán)中心的平均距離為0.51 nm［圖10（a）藍(lán)色散點(diǎn)。注：距離越近，疏水作用越強(qiáng)，平均距離以最近距離氨基酸為準(zhǔn)，此處不考慮I382，見圖10（b）］，因此能夠通過疏水堆積穩(wěn)定果糖在+1 亞位點(diǎn)的結(jié)合［圖11（a）］；當(dāng)果糖以1號位羥基靠近葡萄糖形成α-1，1 糖苷鍵（海藻酮糖）時(shí)，由于果糖1 號位羥基定位的限制，果糖基偏離+1 亞位點(diǎn)，疏水簇與糖環(huán)中心的平均距離為0.57 nm［圖10（a）橙色散點(diǎn)、圖11（b）］，疏水簇的堆積作用較弱，因此S271A生成松二糖的能力較強(qiáng)。

在雙突變體S271A/I382Q 中，當(dāng)果糖以3 號位羥基靠近葡萄糖形成α-1，3 糖苷鍵（松二糖）時(shí)，僅I314 能夠提供疏水相互作用，并且I314 與糖環(huán)中心的平均距離為0.61 nm［圖10（c）藍(lán)色散點(diǎn)、圖11（c）］，遠(yuǎn)于S271A 中的0.51 nm，疏水相互作用減弱，但是Q382 可通過側(cè)鏈氨基與果糖6 號位羥基形成氫鍵（0.30 nm）［圖10（d）紫色散點(diǎn)、圖11（c）］，彌補(bǔ)疏水作用的減弱，最終也能穩(wěn)定果糖在+1亞位點(diǎn)的結(jié)合。當(dāng)果糖以1號位羥基靠近葡萄糖形成α-1，1 糖苷鍵（海藻酮糖）時(shí)，同樣由于果糖1 號位羥基定位的限制，果糖基偏離+1 亞位點(diǎn)，I314 與糖環(huán)中心的平均距離為0.70 nm［圖10（c）橙色散點(diǎn)］，遠(yuǎn)于S271A 中的0.57 nm。同時(shí)，由于Q382不能和果糖的羥基形成氫鍵（0.56 nm）［圖10（d）綠色散點(diǎn)、圖11（d）］，導(dǎo)致果糖以該構(gòu)象與酶結(jié)合的能力很差。因此，與S271A 相比，S271A/I382Q 具有生成松二糖的更大優(yōu)勢，而副產(chǎn)物海藻酮糖合成能力甚微。

圖10 CcSH突變體與松二糖/海藻酮糖相關(guān)距離隨時(shí)間的演變過程Fig.10 Time evolution of relative distances between CcSH single/double mutants and turanose/trehalulose

圖11 CcSH突變體與松二糖/海藻酮糖復(fù)合物的相互作用分析Fig.11 Interaction analysis between CcSH mutants and turanose/trehalulose complex

綜合上述分析，S271A/I382Q 中I382Q 的引入在保證松二糖果糖單元穩(wěn)定結(jié)合的情況下，降低了對海藻酮糖果糖單元的結(jié)合，因此可以降低副產(chǎn)物海藻酮糖的生成，提高產(chǎn)物松二糖的特異性。

3 結(jié) 論

在蛋白結(jié)構(gòu)模擬的基礎(chǔ)上，通過對S271A 活性中心理性分析，選取4個(gè)可能與副產(chǎn)物形成有關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行突變，其中雙突變體S271A/I382Q松二糖產(chǎn)量提高，副產(chǎn)物海藻酮糖顯著降低。進(jìn)一步優(yōu)化了S271A/I382Q 制備松二糖的工藝。結(jié)果表明，以2 mol/L 的蔗糖為底物，加酶量為40 U/mL，在pH 5.0，30 ℃的條件下反應(yīng)48 h 時(shí)，松二糖產(chǎn)率最高為70.3%，濃度為480 g/L，為國內(nèi)外報(bào)道的最高水平，并且無副產(chǎn)物海藻酮糖生成。此外，分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，與S271A 相比，S271A/I382Q +1 亞位點(diǎn)與果糖單元的疏水作用降低，但通過氫鍵相互作用能夠穩(wěn)定果糖參與形成α-1，3糖苷鍵時(shí)的構(gòu)象，因此提升了生成松二糖的反應(yīng)特異性。