FSH 抑制大鼠卵泡顆粒細(xì)胞Hippo 信號通路促進(jìn)雌激素合成

陳泰任， 吳夢靜， 董玉婷， 孔 斌， 蔡玉芳， 黑常春，吳 凱， 趙承軍，2， 常 青，2，3

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系，銀川 750004； 2.寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）是由垂體的促性腺細(xì)胞合成的糖蛋白激素。在卵巢中，F(xiàn)SH 對顆粒細(xì)胞（granulosa cells GCs）的生長和雌激素的產(chǎn)生起著重要作用[1-3]。FSH 可以調(diào)控芳香化酶（CYP19A1）的表達(dá)，CYP19A1 是雌激素產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，主要存在于卵泡GCs 中，通過催化作用將GCs 中由卵泡膜細(xì)胞合成的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。FSH 通過許多途徑調(diào)控CYP19A1的表達(dá)，比如通過循環(huán)單磷酸腺苷（cAMP）途徑調(diào)控CYP19A1 的活性等，但是仍然有許多調(diào)控途徑不是很清楚[4-6]。Hippo 信號通路可以調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡[7-9]。在卵巢中，當(dāng)Hippo 信號通路失活時(shí)，通路中的MST1/2、LATS1/2 因子磷酸化也被抑制，導(dǎo)致關(guān)鍵因子YAP 進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TEAD 相互作用促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)GCs 增殖并合成雌激素。相反，當(dāng)Hippo 通路激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致MST1/2，LATS1/2 磷酸化，從而引起YAP 因子磷酸化并滯留在細(xì)胞質(zhì)中，抑制GCs 生長與雌激素的合成[10]。因此，課題組以大鼠原代卵泡GCs 為研究對象，探索FSH 是否可通過抑制Hippo 信號通路增強(qiáng)GCs 雌激素的合成。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36 只3 周齡SD 大鼠（SPF 級），由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號:SCXK（寧）2020-0001］。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》進(jìn)行。

1.2 主要試劑

FSH（Solarbio 公司）、Verteporfin（VP、YAP的特異性抑制劑[11]，Solarbio 公司）、孕馬血清（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）購自Prospec-Tany 公司；DMEM/F-12 培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青鏈霉素均購自BI 公司。兔抗YAP（AF6328，Affbiotech 公司）、兔抗P-YAP［Phospho-YAP1（Ser127），bs-3475R，Bioss 公司］、兔抗LATS1（17049-1-AP，Proteintech 公司）、兔抗P-LATS1（Phospho-LATS1，bs-3246R，Bioss 公司）、兔抗CYP19A1（Aromatase，ABclonal 公司）；二抗（HRP Goat Anti-Rabbit IgG，AS104，ABclonal公司；Dylight 488，Goat Anti-Rabbit IgG，綠光，A23220，Abbkine 公司）、DAPI（fluorescent sealing agent，ZLI-9557，北京中杉金橋公司）、ELISA 雌二醇（estradiol，E2）檢測試劑盒（CEA461Ge，Cloud-Clone Corp），乙醇、二甲苯等其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 大鼠原代卵泡GCs 分離與培養(yǎng)

GCs 的提取及培養(yǎng)參考已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法[12]并加以改進(jìn)。大鼠腹腔注射PMSG（10 IU/只）36 h后取材，脫頸處死大鼠后從雙側(cè)背部迅速取出卵巢置于PBS 中，剝離卵巢周圍多余脂肪以及輸卵管等組織，用PBS 清洗后，置于含DMEM/F12 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用1 mL 注射器針頭在體式鏡下刺破卵泡，收集GCs 至無菌離心管，離心（1 000 r·min-1，5 min），棄上清，沉淀加入培養(yǎng)基混勻，以5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞密度接種到含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中，部分培養(yǎng)皿中事先放入蓋玻片（細(xì)胞爬片）。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，鏡下觀察并更換培養(yǎng)液，細(xì)胞爬片取出用4%多聚甲醛液固定30 min后進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光純度鑒定。隨后將細(xì)胞分為對照組（無干預(yù)）、FSH 組（0.3 IU·mL-1）、VP 組（10 μg·mL-1）、FSH+VP 組（10 μg·mL-1VP+0.3 IU·mL-1FSH 聯(lián)合干預(yù)），F(xiàn)SH 和VP 的干預(yù)劑量參考文獻(xiàn)[13-14]繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)時(shí)間參考文獻(xiàn)[12，15]，保留各組的培養(yǎng)液存放于-80 ℃，后續(xù)用ELISA 試劑盒測定培養(yǎng)液中E2 濃度。

培養(yǎng)結(jié)束后，各組培養(yǎng)皿上的貼壁GCs 用細(xì)胞刮刮下，放入試管中離心后保留沉淀，-80 ℃保存，用于分子生物學(xué)研究。

1.4 HE 染色觀察大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)

將培養(yǎng)24 h 的細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定30 min，浸于蘇木素溶液中2 min 后流水沖洗15 min，夾取爬片在1%鹽酸乙醇中蘸一下，即刻流水沖洗15 min 后伊紅染色10 min，各濃度梯度乙醇脫水2 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各透明5 min，中性樹膠封片，晾干后顯微鏡下觀察和拍照。

1.5 免疫熒光檢測GCs 純度

細(xì)胞培養(yǎng)至24 h，將細(xì)胞爬片進(jìn)行固定，固定之后每孔加入400 μL 0.2%Triton，破膜10 min，PBS 漂洗3 次，5 min/次，每孔加入400 μL 進(jìn)口山羊血清，封閉30 min。封閉結(jié)束后加一抗兔抗FSHR（1∶250）孵育，4 ℃過夜后復(fù)溫25 min，PBS漂洗3 次，5 min/次，熒光標(biāo)記二抗（Dylight 488，Goat Anti-Rabbit IgG，綠光，1∶1 000）避光孵育2 h，PBS 清洗后封片劑（含DAPI）封片、拍照。陰性對照組用無菌PBS 代替一抗。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，則本批樣本可以繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot 檢測各組GCs 相關(guān)蛋白的表達(dá)

GCs 從-80 ℃取出后用蛋白提取試劑盒裂解、提取蛋白，用BAC 法測定蛋白樣品濃度后加入一定量5×loading buffer，加水配平，100 ℃煮15 min。在10% SDS-PAGE 凝膠上進(jìn)行電泳，每孔8 μL（40 μg 蛋白量）樣本，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶溶液封閉2 h 后YAP、P-YAP、LATS1、P-LATS1、CYP19A1 一抗孵育（均兔抗鼠1∶1 000）4 ℃過夜，第2 天加入二抗（山羊抗兔1∶5 000）常溫孵育1 h 后用ECL 法發(fā)光曝光條帶，用ImageJ 軟件分析各組蛋白灰度值，內(nèi)參為β-actin。

1.7 ELISA 測定各組GCs 培養(yǎng)液的E2 濃度。

將各組GCs 的培養(yǎng)液從-80 ℃拿出，1 000×g離心20 min，取上清，按照說明書運(yùn)用ELISA 競爭抑制法測定E2 濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠GCs 形態(tài)觀察與純度鑒定

GCs 培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞貼壁聚集生長，呈梭形或星形。免疫熒光染色后，鏡下可見FSHR 表達(dá)在GCs 細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)綠色細(xì)小顆粒，DAPI 染核后呈深藍(lán)色。GCs 純度=FSHR 陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)，本實(shí)驗(yàn)得到的細(xì)胞純度鑒定結(jié)果為（93.33±3.09）%，純度達(dá)到進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，見圖1。

圖1 大鼠GCs 形態(tài)觀察與純度鑒定

2.2 Western blot 檢測各組大鼠GCs 相關(guān)蛋白表達(dá)

與對照組相比，F(xiàn)SH 組中LATS1、YAP、CYP19A1表達(dá)均升高，P-LATS1、P-YAP 表達(dá)均降低（P 均＜0.05）；VP 組中LATS1、YAP、CYP19A1 表達(dá)均降低，P-LATS1、P-YAP 表達(dá)均升高（P均＜0.05）。與FSH 組相比，VP 組和VP+FSH 組中LATS1、YAP、CYP19A1 表達(dá)均降低，P-LATS1、P-YAP 表達(dá)均升高（P 均＜0.05）。與VP 組相比，VP+FSH組中LATS1、YAP、CYP19A1 表達(dá)均升高，P-LATS1、P-YAP 表達(dá)均降低（P 均＜0.05），見圖2。

圖2 Western blot 檢測各組大鼠GCs 相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 各組大鼠GCs 培養(yǎng)液中E2 濃度比較

與對照組相比，E2 在FSH 組中濃度升高，在VP 組中降低（P 均＜0.05）。與FSH 組相比，E2 在VP 組和VP+FSH 組中均降低（P 均＜0.05）。與VP組相比，VP+FSH 組的E2 濃度升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 ELISA 測定各組大鼠GCs 培養(yǎng)液中E2 濃度

3 討論

FSH 通過多個(gè)途徑調(diào)控GCs 生長和雌激素的合成[4，16]。本研究中，Western blot 結(jié)果顯示，LATS1、YAP 在FSH 干預(yù)后升高，P-LATS1、PYAP 降低。在VP 干預(yù)后，LATS1、YAP 降低，PLATS1、P-YAP 升高。在VP+FSH 組中，F(xiàn)SH 可以逆轉(zhuǎn)VP 干預(yù)的影響。LATS1、YAP 都是Hippo 信號通路中的因子，當(dāng)Hippo 通路處于抑制狀態(tài)時(shí)，通路中LATS1 和YAP 表達(dá)升高。而當(dāng)Hippo 信號通路激活時(shí)，非磷酸化的LATS1 和YAP 降低，LATS1 磷酸化（P-LATS1）升高，并且進(jìn)一步導(dǎo)致YAP 磷酸化（P-YAP）升高[7]。VP 是YAP 的特異性抑制劑[11]，但其對YAP 的抑制被FSH 逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明，F(xiàn)SH 可以抑制Hippo 信號通路，升高GCs 中LATS1 和YAP 的表達(dá)。

CYP19A1 是雌激素生成的重要因子[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)YAP 被VP 抑制之后CYP19A1 也被抑制，而當(dāng)YAP 被FSH 升高后CYP19A1 也升高，且FSH 可以逆轉(zhuǎn)VP 對YAP 和CYP19A1 的抑制，表明FSH 可以通過YAP 正調(diào)控CYP19A1 的表達(dá)。

ELISA 結(jié)果顯示，F(xiàn)SH 可以促進(jìn)GCs 中E2的合成，VP 可抑制GCs 中E2 的合成，VP+FSH聯(lián)合干預(yù)后，VP 對GCs 中E2 合成的抑制作用被FSH 逆轉(zhuǎn)。VP 作為YAP 的抑制劑，在抑制YAP的同時(shí)，抑制了CYP19A1 和E2 的合成，而FSH可以逆轉(zhuǎn)VP 的作用，表明FSH 可以升高YAP和CYP19A1 的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)E2 的生成。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH 可通過抑制Hippo 信號通路，促進(jìn)GCs 中CYP19A1 的表達(dá)與雌激素的合成。