結(jié)直腸癌壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 預(yù)后風(fēng)險模型構(gòu)建

劉德明， 郭天康，2

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.甘肅省人民醫(yī)院，蘭州 730000）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率一直位居前列[1]。近年來手術(shù)及放化療可明顯提升患者的生存率[2]，但放化療的耐受性問題仍使CRC 的治療屢屢受挫[3]，迫切需要新型診療措施。

壞死性凋亡是一種受高度調(diào)控的區(qū)別于細(xì)胞凋亡和壞死的程序性死亡形式[4]，既可促使腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，也可促進(jìn)CXCL1 蛋白生成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5-6]。因此，探尋更精準(zhǔn)的壞死性凋亡相關(guān)靶向分子至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是包含200 個以上核苷酸序列的非編碼RNA，可在多階段調(diào)控基因的表達(dá)并影響其功能，促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)展[7]。探索壞死性凋亡lncRNA，可更深入理解壞死性凋亡在癌癥進(jìn)展中的作用，并獲得具有潛在價值的治療靶向分子。

本研究結(jié)合遞歸特征消除算法（recursive feature elimination，RFE）及單、多因素Cox 回歸分析，構(gòu)建壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 的預(yù)后風(fēng)險模型，評價風(fēng)險模型在患者預(yù)后及抗癌藥物治療敏感性中的預(yù)測價值，為研究CRC 的診治和分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）中下載CRC 患者RNA-seq 數(shù)據(jù)集及相關(guān)臨床信息?；贕encode 數(shù)據(jù)庫（https://www.gencodegenes.org/human/）下載轉(zhuǎn)置文件，進(jìn)行基因ID 注釋轉(zhuǎn)換。

1.2 篩選壞死性凋亡相關(guān)lncRNA

采用R 軟件Limma 包，設(shè)定參數(shù)：|logFC|>1，P<0.05，獲取CRC 患者癌組織和正常組織的差異lncRNA（DElncRNAs），結(jié)果以火山圖展示。從GSEA（https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）、KEGG 數(shù)據(jù)庫（https://www.genome.jp/kegg/）及已發(fā)表文獻(xiàn)[8]中獲取壞死性凋亡相關(guān)的編碼蛋白基因?；赟pearman 相關(guān)分析，設(shè)定參數(shù)：|r|>0.5，P<0.001，獲取相關(guān)性lncRNA。通過Venn在線工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）求取差異lncRNA 與相關(guān)lncRNA的交集，將其結(jié)果作為壞死性凋亡相關(guān)lncRNA，并進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 篩選最優(yōu)特征lncRNA 并構(gòu)建預(yù)后模型

基于患者臨床信息，排除無生存數(shù)據(jù)及生存時間<30 d 的患者，通過單因素Cox 分析，篩選與CRC 生存相關(guān)lncRNA（P<0.05）。使用R 軟件Caret 包將整體數(shù)據(jù)集按50%分割為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。在訓(xùn)練集中，使用RFE 函數(shù)算法[9]，以最大準(zhǔn)確度Accuracy 篩選出最優(yōu)特征lncRNA 組合。隨后通過My.stepwise 包進(jìn)行多因素Cox 分析，進(jìn)一步篩選最佳lncRNA 組合，并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型。根據(jù)訓(xùn)練集中的中位風(fēng)險評分，將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組。

1.4 模型的驗(yàn)證及分層預(yù)后評估

在訓(xùn)練集、驗(yàn)證集和整體集中采用survival ROC 包和survival 包，分別繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲 線[10]和Kaplan-Meier 曲線[11]，對模型的預(yù)后價值進(jìn)行評估。隨后，采用單因素和多因素Cox 回歸分析，評估不同臨床特征及風(fēng)險評分作為CRC 獨(dú)立預(yù)后因子的潛力，結(jié)果使用森林圖展示。最后，依據(jù)不同臨床特征將患者進(jìn)行分層并進(jìn)行生存分析，評估風(fēng)險模型在CRC 患者的適用性。

1.5 模型在抗癌藥物敏感性分析中的價值評估

使用pRRophetic 包[12]，預(yù)測CRC 整體集中患者對常見抗癌藥物的治療反應(yīng)，根據(jù)不同風(fēng)險模型分組中的IC50值，評估模型對CRC 患者抗癌藥物選擇中的指導(dǎo)價值。

1.6 列線圖構(gòu)建及校正曲線分析

基于多因素Cox 結(jié)果，將有意義的因素納入模型，并構(gòu)建列線圖，預(yù)測CRC 患者1、3、5 年總體生存率?；赾alibrate 函數(shù)，繪制校準(zhǔn)曲線，評估預(yù)測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相符度，并通過rmda包繪制決策曲線分析（DCA），評估模型與臨床特征在預(yù)測患者生存方面的優(yōu)劣性。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)處理及壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 的篩選

基于TCGA 數(shù)據(jù)集RNA-seq 表達(dá)值處理，獲得568 例CRC 組織，44 例正常結(jié)腸組織表達(dá)值。差異分析共篩選出2 961 個上調(diào)DElncRNAs，2 680 個下調(diào)的DElncRNAs，結(jié)果以火山圖（圖1A）展示。從數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中共獲得144 個壞死性凋亡相關(guān)的編碼蛋白基因，基于Spearman 相關(guān)分析，共獲得1 973 個相關(guān)性lncRNA。韋恩圖對兩組lncRNA 交集分析，共獲得716 個壞死性凋亡相關(guān)lncRNA，其中425 個上調(diào)，291 個下調(diào)（圖1B、圖1C）。

圖1 壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 的篩選

2.2 最優(yōu)特征lncRNA 的篩選

基于生存信息，共納入446 例患者表達(dá)值及臨床信息進(jìn)行后續(xù)分析。經(jīng)單變量Cox 分析，獲得41 個生存相關(guān)lncRNA（圖2）。通過RFE 函數(shù)算法，對上述lncRNA 分析，以結(jié)果最優(yōu)參數(shù)（最大準(zhǔn)確度Accuracy=0.8121），見圖3A，篩選出28個最優(yōu)特征lncRNA。

圖2 壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 單因素Cox 分析森林圖

2.3 預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建

采用My.stepwise 包進(jìn)一步篩選最佳lncRNA組合，最終納入7 個lncRNA，分別是ZNF451-AS1、RP5-1021I20.1、AP001505.10、RP11-421L21.3、KANSL1L-AS1、RP1-18D14.7、RP11-49K24.8，森林圖展示結(jié)果分析（圖3B）。使用7 個最優(yōu)lncRNA構(gòu)建風(fēng)險模型，模型一致性指數(shù)（concordance index）為0.79，赤池信息量準(zhǔn)則（akaike information criterion，AIC）為366.17。風(fēng)險評分（riskscore）計(jì)算公式如下：

coef（lncRNAk）表示第K 個lncRNA 的多因素Cox 比例風(fēng)險回歸系數(shù)，expre（lncRNAk）表示第K 個lncRNA 的表達(dá)值。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，將訓(xùn)練集的風(fēng)險評分中位數(shù)（0.9574）作為風(fēng)險模型評分的截?cái)嘀怠?/p>

2.4 模型驗(yàn)證及預(yù)后評估

ROC 曲線結(jié)果顯示，該模型在訓(xùn)練集（圖4A）的1、3、5 年曲線下面積（AUC）分別為0.842、0.815和0.715，測試集（圖4B）分別為0.719、0.732 和0.658，整體集（圖4C）中分別為0.758、0.773 和0.698。Kaplan-Meier 曲線結(jié)果提示，在訓(xùn)練集，測試集和整體集中，高風(fēng)險組患者均呈現(xiàn)為較差的預(yù)后結(jié)果（圖3D～F）。不同臨床特征分層中的生存曲線分析，高風(fēng)險組在不同年齡階段（>65歲vs≤65 歲）、性別（男vs 女）、不同AJCC 分期（Ⅰ/ⅡvsⅢ/Ⅳ）、T 分期（T1/2 vs T3/4）、N 分期（N0 vsN1/2）、M 分期（M0 vs M1）均具有較差的預(yù)后。單變量及多變量Cox 獨(dú)立預(yù)后分析結(jié)果顯示，年齡、AJCC 分期、T 分期及風(fēng)險評分均可作為CRC患者預(yù)后的獨(dú)立因子。

圖3 最優(yōu)特征lncRNA 組合篩選

圖4 風(fēng)險模型的預(yù)后評估

2.5 模型在抗癌藥物選擇中的價值評估

通過pRRophetic 包，預(yù)測TCGA 數(shù)據(jù)庫CRC患者對138 種抗癌藥物治療的IC50評分，評估高、低風(fēng)險組患者對抗癌藥物的敏感性。結(jié)果顯示，高風(fēng)險組對7 種抗癌藥物（BI.2536、BIRB.0796、CMK、IPA.3、Lenalidomide、PD.173074、QS11）敏 感性低，對6 種抗癌藥物（AKT.inhibitor.ⅤⅢ、BMS.708163、JNJ.26854165、Lapatinib、MG.132、Temsirolimus）敏感性高。

2.6 列線圖構(gòu)建及評估

基于多因素Cox 分析，將年齡、AJCC 分期、T分期及風(fēng)險評分納入模型，構(gòu)建列線圖，預(yù)測CRC患者1、3、5 年的預(yù)后（圖5A）。校正曲線顯示列線圖預(yù)測結(jié)果與患者實(shí)際生存狀態(tài)基本相符（圖5B）。同時，DCA 曲線顯示列線圖相較于臨床分期等，預(yù)測能力具有明顯的優(yōu)勢（圖5C）。

圖5 預(yù)測結(jié)直腸癌患者1、3、5 年總體生存率的列線圖及評估

3 討論

近年來由于轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高，且缺乏個體化治療的有效靶點(diǎn)，CRC 仍然是非常棘手的癌癥。探索CRC 進(jìn)展的分子機(jī)制以獲得更多潛在治療靶點(diǎn)，具有重要意義。

壞死性凋亡是細(xì)胞死亡的一種裂解形式，是防止細(xì)胞凋亡受阻而被激活的細(xì)胞自我破壞的過程，在某些退行性或炎性疾病中起到消滅病原體感染的細(xì)胞或受損細(xì)胞的作用[13]。區(qū)別于凋亡過程，該過程的激活不依賴caspase 激酶激活，在caspase 抑制的條件下，死亡受體與配體的結(jié)合可觸發(fā)壞死性凋亡[14-15]。壞死性凋亡在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展過程中產(chǎn)生的作用具有雙重性，既可增強(qiáng)細(xì)胞免疫[16]，起抗腫瘤作用，也可刺激腫瘤形成免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5]。既往研究[17]顯示，基于胞內(nèi)RIP-1 以及MLKL 的活性，5-FU 與ZVAD（caspase 抑制劑）聯(lián)合處理CRC 細(xì)胞，可促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡，說明壞死性凋亡在腫瘤耐藥研究中的重要價值。RFE 是通過遞歸的方式移除特定變量，消除變量之間的冗余，保留對預(yù)測目標(biāo)屬性貢獻(xiàn)大的變量，并重新構(gòu)建最優(yōu)組合變量[9]。其主要思想是重復(fù)構(gòu)建模型，遍歷所有特征變量，直至篩選出最佳特征變量，該算法是一種尋找最優(yōu)特征子集的“貪心”算法[18]。在特征變量的篩選及診斷或預(yù)后模型構(gòu)建中起到重要作用。

本研究中，通過Cox 分析及RFE 算法最終納入7 個lncRNA 構(gòu)建風(fēng)險模型，通過對模型ROC 曲線和生存曲線分析，該模型風(fēng)險評分對CRC患者1、3、5 年的預(yù)后具有良好的預(yù)測能力，且該模型在不同臨床特征分層中均呈現(xiàn)一定預(yù)后意義，表明該模型對患者的預(yù)后評估不受年齡、性別、腫瘤分期的影響，具有較高的普適性、可靠性及穩(wěn)定性。此外，風(fēng)險評分結(jié)合患者年齡、AJCC 分期，T分期構(gòu)建的列線圖顯示出了高效的生存預(yù)測能力，可為臨床工作者評估患者預(yù)后提供一定的幫助?？拱┧幬锩舾行苑治?，可輔助臨床醫(yī)生制定有效的治療策略，基于R 軟件中pRRophetic 包，本研究預(yù)測不同風(fēng)險組中患者對抗癌藥物的敏感性，為臨床治療策略的制定提供一定的參考價值。

lncRNA 在基因組中占比較大，可通過影響染色質(zhì)修飾、RNA 轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)活性等方式在多個層面調(diào)控基因的表達(dá)[19]。lncRNA 可影響癌癥的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及化療耐藥，靶向lncRNA 的抗癌研究具有重要的意義。本研究的模型中，5 個lncRNA 為保護(hù)因子（ZNF451-AS1、RP5-1021I20.1、AP001505.10、KANSL1L-AS1、RP1-18D14.7），2 個為危險因子（RP11-421L21.3、RP11-49K24.8）。ZNF451-AS1 在CRC 中呈現(xiàn)保護(hù)性作用，有研究[20]發(fā)現(xiàn)，ZNF451-AS1 在頭頸部腫瘤中下調(diào)，與本研究結(jié)果一致，可能在抑制腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮的作用一致。而其余6 個lncRNA 目前尚無報(bào)道。

本研究用多種方法驗(yàn)證了風(fēng)險模型的有效性和穩(wěn)定性，但仍存在不足。該研究的真實(shí)性缺乏臨床數(shù)據(jù)及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，且結(jié)果的可靠性依靠TCGA 數(shù)據(jù)集的準(zhǔn)確性。下一步應(yīng)通過臨床實(shí)踐及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證本研究結(jié)果。

綜上所述，本研究構(gòu)建的壞死性凋亡相關(guān)lncRNA 的風(fēng)險模型可以穩(wěn)定、有效地預(yù)測CRC 患者的預(yù)后，并可能為臨床醫(yī)生制定治療策略提供參考依據(jù)，也為今后研究CRC 的分子機(jī)制、生物標(biāo)記物及探索新型的治療靶點(diǎn)提供了新的思路。