新疆地區(qū)綠僵菌菌株篩選及抗逆性研究

霍英慧，陳 娟，王 晗，葉小芳，于 非

(1.新疆師范大學生命科學學院，新疆特殊環(huán)境物種保護與調控生物學實驗室，中亞區(qū)域跨境有害生物聯(lián)合控制國際研究中心，烏魯木齊 830054；2. 慕恩(廣州)生物科技有限公司，廣州 510700)

綠僵菌Metarhizium具有較強的致病力，防治效果好，對人畜和生態(tài)環(huán)境安全，因此被用于農(nóng)業(yè)和林業(yè)的害蟲防治(Zimmermann, 1993)。蝗蟲為植食性昆蟲，主要取食禾本科、豆科及莎草科植物，且分布范圍廣，可以棲息在農(nóng)田、沼澤、濱湖、草原、森林、荒漠、沙漠等多種環(huán)境，并具有遷飛行為。因此，蝗災被認為是世界性嚴重的生物災害之一(黃博，2012)。長期以來，人們主要是采用化學農(nóng)藥進行農(nóng)業(yè)害蟲防治，雖然在短時間內對害蟲能夠起到一定的防治作用，但是，隨著用藥次數(shù)的增多，“3R”問題(即土壤中農(nóng)藥殘留(Residue)，害蟲產(chǎn)生抗藥性(Resistence)，生態(tài)平衡被破壞造成的害蟲再猖獗(Resurgence))逐漸顯現(xiàn)。利用生物或生物代謝產(chǎn)物來控制病蟲草害的生物防治技術是害蟲持續(xù)控制不可缺少的組成部分(陳學新，2010)。生物防治作為一種環(huán)境友好型的害蟲防治方法，具有不污染環(huán)境、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，越來越受到人們的關注(陶星虎，2014；Dara, 2019)。微生物農(nóng)藥是一種重要的農(nóng)藥類型，由于其毒性較小，對于生態(tài)環(huán)境的影響也比較小，且能夠保護人畜安全，因此成為一種重要的生物防治手段(李增智和樊美珍，2000；王海龍，2017)。真菌殺蟲劑能夠與體壁接觸對昆蟲直接侵染，而不需要其他外力的幫助，從而實現(xiàn)殺蟲的目的(Mecoy, 1981; Roberts, 1981; Gillespieetal., 2000)。綠僵菌作為一種昆蟲病原真菌，是一種有效的真菌殺蟲劑，已被廣泛應用于多種害蟲的生物防治，效果顯著(張宗炳和曹驥，1990；郭素萍，2004)。

目前，國內外已有較多關于綠僵菌的生物學特性和致病機理的研究。溫度、紫外線、干旱均會影響綠僵菌的防治效果。溫度在一定程度上影響綠僵菌的生長及致病力，溫度過高或者過低均造成綠僵菌產(chǎn)孢量及致病力下降；紫外線和干旱也會對孢子的萌發(fā)產(chǎn)生阻礙作用，使得菌株的致病力降低。前期研究表明，新疆地區(qū)有豐富的綠僵菌資源(段玉林，2017)，本研究通過高溫、紫外線和干旱的強度測試來篩選出抗性和環(huán)境適應性強的菌株，從而提高防治蝗蟲的效果。本課題組前期從野外土壤中分離、采集的菌株，經(jīng)毒力測定挑選出5株高毒力的綠僵菌菌株。本文旨在測定這5株綠僵菌的抗逆性，篩選出致病力高且抗逆性好的菌株，為下一步開發(fā)適應于新疆高溫、強紫外線、干旱生境蝗蟲防治的綠僵菌生物農(nóng)藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高毒力綠僵菌菌株的篩選

1.1.1供試菌株

本實驗室前期在新疆南北疆地區(qū)采集土壤樣品，并從中分離得到綠僵菌、經(jīng)初步篩選后保存的17株生長性狀較好的菌株。將供試菌株接到PDA平板后在26.0±1.0℃培養(yǎng)，待產(chǎn)生分生孢子后備用。

1.1.2供試昆蟲來源和飼養(yǎng)

東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis，新鮮蝗卵于培養(yǎng)箱中孵化后在培養(yǎng)室內以新鮮小麥苗和玉米草連續(xù)人工飼養(yǎng)至3齡，飼養(yǎng)條件為溫度28.0℃～30.0℃、相對濕度40%～70%、光周期L ∶D=16 h ∶8 h。

1.1.3孢子懸浮液的配置

配制1.0×108孢子/mL孢子懸液：取實驗待用菌株，用0.05%Tween-80溶液洗脫孢子，經(jīng)攪拌、震蕩、過濾后計數(shù)，配制成1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液備用。

1.1.417株綠僵菌菌株對東亞飛蝗3齡蝗蝻致病力的初步測定

取濃度為1.0×108孢子/mL的孢子懸浮液，將此濃度設3個重復，每個重復15頭試蟲。用微量注射器吸取上述懸浮液滴于3齡蝗蝻前胸背板，接種劑量為10 μL，對照組用等量0.05%Tween-80溶液接種。處理后放入養(yǎng)蟲盒中，用新鮮小麥苗和玉米草作食料，每天更換1次。在飼養(yǎng)條件下連續(xù)觀察10 d，每天定期檢查及記錄死亡的蝗蝻數(shù)量，并將死亡的蝗蝻進行體表消毒后在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7～14 d，根據(jù)蟲體是否長出菌絲及菌絲形態(tài)確定蝗蟲死亡的原因，統(tǒng)計死亡數(shù)、僵蟲數(shù)，計算死亡率、僵蟲率，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.2 高毒力綠僵菌菌株抗逆性的研究

選取上述實驗篩選出的5株較高毒力的綠僵菌，進行抗逆性研究。

1.2.1孢子懸浮液的配制

制成1.0×106孢子/mL孢子懸液備用。

1.2.2綠僵菌菌株耐短時高溫能力的研究

1.2.2.1 高溫處理對綠僵菌懸浮液分生孢子萌發(fā)率的影響

將孢子懸浮液分別裝在滅菌的試管中，裝好后封口，分別放置在溫度不同的水浴鍋中恒溫加熱30 min，溫度分別為30、35、40、45、50℃。對照組不做加熱處理，每組3個重復。取1 μL孢子懸浮液涂布于PDA培養(yǎng)基平板上，封口后置于26.0±1.0℃培養(yǎng)環(huán)境中恒溫培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計各個平板中的菌落數(shù)，計算孢子萌發(fā)率。

1.2.2.2 高溫處理對綠僵菌生長情況的影響

取1.2.2.1中處理過的孢子懸液10 μL滴于PDA平板中央，對照組滴等量未經(jīng)處理的孢子懸浮液，分別設3次重復。置于恒溫培養(yǎng)箱中26.0±1.0℃條件下培養(yǎng)，第3天至第7天每天觀察菌落生長情況，測量菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3綠僵菌菌株抗紫外線能力的研究

1.2.3.1 紫外線處理對綠僵菌懸浮液分生孢子萌發(fā)率的影響

取孢子懸浮液1 μL均勻涂布于PDA平板，將平板置于超凈工作臺紫外燈下，分別照射1、2、4、6、10 min，后于26.0±1.0℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以未經(jīng)照射的作對照，每個處理設3次重復。培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計記錄各處理平板中菌落數(shù)，計算各菌株各處理的孢子萌發(fā)率。

1.2.3.2 紫外線處理對綠僵菌生長情況的影響

吸取孢子懸浮液10 μL滴至PDA培養(yǎng)基中央，置于超凈工作臺紫外燈下，分別照射1、2、4、6、10 min，將平板置于26.0±1.0℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以未經(jīng)照射的作對照，每個處理設3次重復。第3天至第7天每天觀察菌落生長情況，測量菌落直徑，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4綠僵菌菌株抗旱力的研究

以SDAY液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，加入10%，20%，30%，40%的PEG200(聚乙二醇)，以未加PEG200的處理為對照，加入孢子懸液后，在26.0±1.0℃下培養(yǎng)24 h，置于顯微鏡下觀察10個視野，統(tǒng)計萌發(fā)數(shù)，測定各菌株萌發(fā)率，每個處理設3個重復。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2016分別計算各處理組的累計死亡率、僵蟲率、LT50；利用Excel 2016分別計算各處理組的菌落直徑、孢子萌發(fā)率，利用0rigin軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 17株綠僵菌菌株對東亞飛蝗3齡蝗蝻致病力的測定

17株綠僵菌菌株對3齡蝗蝻的致病力的初步測定結果，可以看出，17株供試綠僵菌菌株對東亞飛蝗均有一定的致病性且致病力有比較大的差異，平均僵蟲率在40.00%～96.67%之間，LT50在2.92～9.95之間。其中，M1-17菌株的平均僵蟲率達到了95.00%以上，且LT50僅為2.92；M1-13、M1-09的平均僵蟲率達到90.00%，LT50為3.11和3.20；M1-16、M1-05的平均僵蟲率達到80.00%，LT50為3.46和3.56，表現(xiàn)出對東亞飛蝗較強的致病性。初選出M1-17、M1-13、M1-09、M1-16、M1-05五株菌株為對蝗蝻高致病力的菌株(表1)。

表1 17株綠菌菌株對東亞飛蝗的死亡率、僵蟲率和致死中時間Table 1 Mortality，rigidity and LT50 of 17 Metarhizium strains to Locusta migratoria manilensis

2.2 對高毒力綠僵菌菌株抗逆性的測定

2.2.1綠僵菌菌株耐短時高溫能力的測定

2.2.1.1 高溫對綠僵菌孢子萌發(fā)率的影響

對初步篩選獲得的5株菌株進行耐短時高溫的測試，可以看出5株菌株分生孢子的萌發(fā)率隨著溫度升高而逐漸降低。在30℃和35℃處理時，萌發(fā)率差異較小，其中30℃處理時，萌發(fā)率最高的是M1-17，為86.55%；其次是M1-13，為83.45%；萌發(fā)率最低的是M1-16，為62.99%。40℃時M1-17仍有較高的萌發(fā)率，萌發(fā)率為78.65%；而M1-09和M1-16的孢子萌發(fā)率僅為40.00%。通過觀察，供試菌株對高于45℃的高溫較敏感，當溫度為45℃時，菌株分生孢子的萌發(fā)率均可達到30%以上，其中M1-17萌發(fā)率最高，為63.57%。當處理溫度為50℃時，5株菌株仍有分生孢子萌發(fā)，萌發(fā)率在18.36%～35.34%之間。綠僵菌M1-17和M1-13在50℃處理后表現(xiàn)出較好的耐高溫能力，較其它3株菌株穩(wěn)定(圖1)。

圖1 高溫對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of high temperature on bourgeon rates ofMetarhizium strains

2.2.1.2 高溫對綠僵菌生長量的影響

通過培養(yǎng)經(jīng)高溫處理后的5株綠僵菌菌株，分別于第3～7天觀察菌落的生長情況并用十字交叉法測量菌落直徑，觀察各菌株生長情況。結果發(fā)現(xiàn)，5株菌株在未經(jīng)處理時，生長情況差異不明顯。隨著溫度升高，各菌株菌落的直徑表現(xiàn)出不同。其中，菌株M1-05和M1-13的生長情況在30℃和35℃時優(yōu)于對照，可能由于特定的溫度促進了分生孢子的生長速度，在40℃和45℃時稍有減弱，當溫度達到50℃，則生長十分緩慢；菌株M1-09和M1-17在溫度低于45℃時生長情況大致相同，對低于45℃的高溫抗性較好，在45℃和50℃時菌株生長情況稍有減弱，第3～4天生長較慢，在第5天開始迅速生長，初步推斷可能由于高溫推遲了孢子的萌發(fā)時間，但在孢子萌發(fā)后，菌株生長迅速；而菌株M1-16隨著溫度的升高，菌株生長態(tài)勢明顯減弱。各菌株對高溫的抗性效果依次為M1-17>M1-05 >M1-13>M1-09>M1-16(圖2)。

圖2 高溫對綠僵菌生長量的影響Fig.2 Effect of high temperature on diameter growth of Metarhizium strains

2.2.2綠僵菌菌株抗紫外線能力的測定

2.2.2.1 紫外線對綠僵菌孢子萌發(fā)率的影響

對獲得的5株菌株進行抗紫外線能力的測試，結果發(fā)現(xiàn)，不同菌株經(jīng)紫外照射后，均對孢子的萌發(fā)產(chǎn)生影響，5株不同菌株對紫外線處理均比較敏感，不同菌株間對紫外線抗性的差異十分明顯。5株綠僵菌菌株的孢子萌發(fā)率基本都隨紫外照射時間的增加而減小。在照射1 min時，菌株M1-17萌發(fā)率最高，為86.72%；M1-13萌發(fā)率最低為51.33%。在照射2～4 min時，菌株M1-16的孢子萌發(fā)率最高且差異不明顯?？傮w來看，M1-16和M1-17菌株孢子的紫外線照射萌發(fā)率最高，紫外線照射對孢子萌發(fā)的影響最小，M1-09菌株次之。在紫外照射10 min時，菌株M1-17對紫外線的抗性最強，萌發(fā)率仍有13.40%，明顯優(yōu)于其它4株菌株(圖3)。

圖3 紫外線對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響Fig.3 Effect of ultra-violet ray on bourgeon rates of Metarhizium strains

2.2.2.2 紫外線對綠僵菌生長量的影響

紫外處理對5株高毒力綠僵菌菌株生長量的影響結果可以看出，5株菌株在未經(jīng)處理時，生長情況差異不明顯。不同菌株經(jīng)紫外照射后，均對菌株的生長產(chǎn)生影響，各菌株的菌落直徑隨紫外照射時間的增加而減小，不同菌株間對紫外線的抗性均有差異。在照射1、2、4 min時，生長情況最好的菌株是M1-05，最差的為M1-09。但隨著照射時間的延長，在照射6 min和10 min時，生長情況最好的菌株為M1-17，最差的為M1-13。每株菌株經(jīng)紫外處理，菌落生長雖受影響，但都保持著一定的生長量，對紫外光均有一定的耐受性，抗紫外能力依次為：M1-17>M1-16>M1-05>M1-09>M1-13(圖4)。

圖4 紫外線對綠僵菌生長量的影響Fig.4 Effect of ultra-violet ray on diameter growth of Metarhizium strains

2.2.3綠僵菌菌株抗旱力的測定

隨著PEG200濃度的增加，菌株的萌發(fā)率逐漸降低。在PEG含量為10%時，對綠僵菌孢子萌發(fā)的抑制作用不明顯，5株菌株萌發(fā)率均可達到85%以上，當PEG200濃度為40%時，對菌株孢子萌發(fā)率的影響與10%處理時有十分顯著的差異，5株菌株的萌發(fā)率僅為22.47%～31.58%，其中，40% PEG200處理對M1-09的抑制作用最小，其次是M1-17和M1-16。在PEG的含量為40%時，綠僵菌M1-09、M1-17和M1-16的萌發(fā)率比較高，說明它們的抗旱能力較其它菌株高(圖5)。

圖5 PEG處理對綠僵菌分生孢子萌發(fā)率的影響 Fig.5 Effect of PEG on bourgeon rates of Metarhizium strains

3 結論與討論

在自然界當中，綠僵菌分布的比較廣泛，且數(shù)量較多，但是不同的菌株對于其寄主昆蟲的毒力各不相同，且外部環(huán)境也會對菌株的毒力產(chǎn)生很大的影響，綠僵菌作為重要的昆蟲病原真菌之一，具有無殘留、對非靶標昆蟲安全、可在田間持續(xù)存留、防治效果好等優(yōu)點。

從本研究17株綠僵菌菌株對3齡蝗蝻的致病力的測定結果可以看出，17株供試綠僵菌菌株對東亞飛蝗均有一定的致病性且致病力有比較大的差異，平均僵蟲率在40.00%～96.67%之間，LT50在2.92～9.95之間。初選出M1-17、M1-13、M1-09、M1-16、M1-05五株對蝗蝻高致病力的菌株。

致病力是衡量綠僵菌菌株優(yōu)良性的重要指標，而菌株致病力的強弱受環(huán)境影響很大。其中，溫度是影響綠僵菌致病力的一個重要因素。溫度可以影響綠僵菌孢子萌發(fā)、菌絲生長、產(chǎn)生分生孢子及孢子活力，綠僵菌制劑在過冷或者過熱的條件下都有可能喪失其活力或者毒力。溫度會對致病速度、致病率產(chǎn)生影響，在一定的溫度范圍之內，溫度的升高會促進孢子的萌發(fā)，使得孢子菌絲的生長速度加快，致病性也能有一定的增加。但是當溫度過高，孢子萌發(fā)則會被抑制，還會使得孢子死亡。具有較高耐熱性的菌株能夠抵抗野外的高溫，并且在環(huán)境溫度方面的適應能力也更好。因此，對于孢子在高溫脅迫下耐受力進行測試與分析，是對優(yōu)良綠僵菌進行篩選的一個重要指標。本研究結果顯示，5株菌株分生孢子的萌發(fā)率隨著溫度升高而逐漸降低。在30℃和35℃處理時，萌發(fā)率差異較??；45℃處理時，萌發(fā)率均可達到30%以上；50℃處理時，仍有分生孢子萌發(fā)。綠僵菌M1-17和M1-13在50℃處理時較其它3株菌株穩(wěn)定。5株菌株在未經(jīng)高溫處理時，菌落生長情況差異不明顯。隨著處理溫度升高，各菌株菌落的生長直徑表現(xiàn)出不同。各菌株對高溫的抗性效果依次為M1-17>M1-05>M1-13>M1-09>M1-16。

在自然生境當中，紫外線是另外一個對于綠僵菌致病力產(chǎn)生影響的重要因素。不同波長的紫外光及太陽光譜的組合成份對綠僵菌有不同程度的傷害(黃冬如，2004)。本研究結果顯示，不同菌株經(jīng)紫外照射后，均對孢子的萌發(fā)產(chǎn)生影響，5株菌株對紫外處理均比較敏感，萌發(fā)率基本都隨紫外照射時間的增加而減小。總體來看，M1-16和M1-17菌株孢子的紫外線照射萌發(fā)率最高，紫外線照射對孢子萌發(fā)的影響最小，M1-09菌株次之。在紫外照射10 min時，菌株M1-17對紫外線的抗性最強，萌發(fā)率仍有13.40%，明顯優(yōu)于其它4株菌株。5株菌株在未經(jīng)紫外處理時，菌落生長情況差異不明顯。經(jīng)紫外照射后，各菌株的菌落直徑隨紫外照射時間的增加而減小。每株菌株經(jīng)紫外處理，菌落生長雖受影響，但都保持著一定的生長量，對紫外光均有一定的耐受性，抗紫外能力依次為：M1-17>M1-16>M1-05>M1-09>M1-13。

含水量也是影響孢子活力的一個重要因素，含水量過高，能夠導致孢子提前萌發(fā)及自溶(石妍，2011)，而含水量過低，能夠導致孢子不萌發(fā)。本研究結果表明，不同菌株的抗旱能力不同，同一菌株在不同的干旱條件下抗旱能力也不同。隨著PEG200濃度的增加，菌株的萌發(fā)率逐漸降低。PEG200濃度為40%時對菌株孢子萌發(fā)率的影響與10%處理時差異極其顯著。在PEG的含量為40%時，綠僵菌M1-09、M1-17和M1-16的萌發(fā)率比較高，因此M1-09、M1-17和M1-16菌株的抗旱能力較其它菌株高。

綜合以上指標可以看出，對高溫的抗性效果較好的菌株為M1-17和M1-05；對紫外線的抗性效果較好的菌株為M1-17和M1-16；而菌株M1-09、M1-17和M1-16抗旱能力較好。研究結果顯示菌株M1-17較其它菌株具有更好的抗逆性，更加適應新疆高溫、干旱、強紫外線的環(huán)境，具有很好的開發(fā)利用價值。本研究通過對新疆本地綠僵菌資源的致病力測定及篩選，得到高致病力及高抗性的菌株，對蝗蟲防治生物制劑的開發(fā)具有重要意義。

致謝：感謝新疆特殊環(huán)境物種保護與調控生物學實驗室、新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調控重點實驗室、干旱區(qū)植物逆境生物學實驗室、中亞區(qū)域有害生物聯(lián)合控制國際研究中心、新疆師范大學校級重點學科生物學學科、新疆師范大學沙漠藻研究院以及慕恩(廣州)生物科技有限公司的大力支持與幫助。