小兒咳喘靈顆粒微生物污染狀況分析

劉靖華 劉艷平 張秀花

小兒咳喘靈顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第四冊(cè)[1]，兒科用藥，由麻黃、生石膏、苦杏仁、瓜蔞、板藍(lán)根、金銀花和甘草組成，配方中板藍(lán)根、金銀花等具有一定的抑菌作用[2-5]，功效是潤肺清熱、止咳化痰，臨床應(yīng)用廣泛。為確保臨床用藥安全，2016—2020年，山東省藥品質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測共計(jì)完成139個(gè)項(xiàng)目，對(duì)有關(guān)風(fēng)險(xiǎn)隱患，做到了早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)警、早處置。2021年，本院繼續(xù)承擔(dān)小兒咳喘靈顆粒風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測項(xiàng)目。微生物限度檢查是評(píng)價(jià)藥品安全性的重要方法，微生物污染過程涵蓋生產(chǎn)、流通、儲(chǔ)存、使用等環(huán)節(jié)。近年來，對(duì)原輔料、包裝容器、潔凈環(huán)境、生產(chǎn)工藝等污染的 研究越來越受到重視[6-10]。本試驗(yàn)首先對(duì)不同企業(yè)的樣品進(jìn)行微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，以消除人員、環(huán)境、試劑耗材等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，然后根據(jù)確立的試驗(yàn)方法對(duì)所有樣品進(jìn)行微生物限度檢查，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，追溯微生物污染關(guān)口，指出存在的風(fēng)險(xiǎn)隱患，為藥品監(jiān)管工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 電子天平（HZT-A1000，福州華志科學(xué)儀器有限公司）、立式壓力蒸氣滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）、生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）、細(xì)菌培養(yǎng)箱（KB240，德國BINDER）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-250F-I，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)210829；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)210620；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)210622；均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

1.1.3 稀釋劑 pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號(hào)20210624，由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

1.1.4 菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]均由中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所提供，試驗(yàn)所用菌株均為第4代。

1.1.5 樣品 小兒咳喘靈顆粒來源分布見表1。

表1 小兒咳喘靈顆粒來源分布

1.2 方法

1.2.1 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

1.2.1.1 菌液制備 將1.1.4項(xiàng)下菌種，分別劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件[6]培養(yǎng)、沖洗、稀釋，制成濃度為104cfu/ml的菌液備用。

1.2.1.2 供試液制備 分別取1.1.5項(xiàng)下樣品10 g， 加1.1.3項(xiàng)下稀釋劑至100 ml，混勻，制成1∶10供試液備用。

1.2.1.3 微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn) 試驗(yàn)組：分別取1.2.1.1項(xiàng)下菌液0.1 ml與1.2.1.2項(xiàng)下供試液9.9 ml，混勻備用；供試品對(duì)照組：分別取1.1.3項(xiàng)下稀釋劑0.1 ml與1.2.1.2項(xiàng)下供試液9.9 ml，混勻備用；菌液對(duì)照組：分別取1.2.1.1項(xiàng)下菌液0.1 ml與1.1.3項(xiàng)下稀釋劑9.9 ml，混勻備用；以上3組分別取1 ml注入平皿中，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1105[11]，加入相應(yīng)的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收率。

1.2.2 控制菌檢查試驗(yàn) 取1.2.1.2項(xiàng)下供試液10 ml至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，以大腸埃希菌為陽性對(duì)照，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，照《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則1106[12]，培養(yǎng)、選擇和分離培養(yǎng)、結(jié)果判斷。

1.2.3 結(jié)果判斷 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)[11]。

2 結(jié)果

2.1 微生物計(jì)數(shù)

由表2可以看出，各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)，符合試驗(yàn)要求，該方法可用于微生物計(jì)數(shù)檢查。

2.2 控制菌檢查

由表3可以看出，陽性對(duì)照呈陽性，陰性對(duì)照呈陰性，符合試驗(yàn)要求，該方法可用于控制菌檢查。

2.3 樣品檢查

由表4可以看出，49批樣品需氧菌總數(shù)均小于103cfu/g，檢出率為30.6%，霉菌和酵母菌總數(shù)均小于102cfu/g，檢出率為20.4%，大腸埃希菌（1 g）均未檢出。

表4 49批樣品微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

本次風(fēng)險(xiǎn)排查抽驗(yàn)任務(wù)，樣品分布廣泛，生產(chǎn)環(huán)節(jié)涉及全國15家企業(yè)，經(jīng)營環(huán)節(jié)涉及全省33家企業(yè)。因原料產(chǎn)地、批次、輔料及生產(chǎn)工藝存在一定差異，不同企業(yè)的方法適用性試驗(yàn)不同[13]。針對(duì)這一問題，首先采用常規(guī)法分別對(duì)15家生產(chǎn)企業(yè)的樣品進(jìn)行微生物限度方法適用性試驗(yàn)。從表2可以看出，15家生產(chǎn)企業(yè)微生物計(jì)數(shù)各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2范圍內(nèi)；從表3可以看出，控制菌檢查陽性對(duì)照組均呈陽性，陰性對(duì)照組均呈陰性。結(jié)果表明，49批樣品均可采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查。

表2 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)各試驗(yàn)菌平均回收比值(n=3)

表3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

微生物限度檢查是非無菌制劑質(zhì)量控制的重要方面，也是保障制劑安全的重要措施[14]。從表4可以看出，49批樣品中需氧菌總數(shù)小于10 cfu/g共34批次，10～100 cfu/g共14批次，101～200 cfu/g共1批次，檢出率為30.6%；霉菌和酵母菌總數(shù)小于10 cfu/g共39批次，10～50 cfu/g共6批次，51～100 cfu/g共4批次，檢出率為20.4%；控制菌均未檢出。結(jié)果符合規(guī)定[15]。從檢出率來看，微生物計(jì)數(shù)的檢出率在20%～30%，說明微生物污染的概率并不高，尤其是霉菌和酵母菌。49批樣品在人、機(jī)、料、法、環(huán)等試驗(yàn)條件完全一致的情況下，個(gè)別數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常，完全可以排除本實(shí)驗(yàn)室對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)，僅霉菌和酵母菌總數(shù)在90～100 cfu/g有3批，結(jié)果為臨界值，與標(biāo)準(zhǔn)限值102cfu/g相近，說明樣品污染的因素可能與原輔料產(chǎn)地、儲(chǔ)存條件、生產(chǎn)環(huán)境等密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3批樣品涉及2家生產(chǎn)企業(yè)，且有1家生產(chǎn)企業(yè)的2批樣品為關(guān)聯(lián)批號(hào)，說明樣品污染的主要原因很可能是原輔料在購進(jìn)或儲(chǔ)存過程中受到微生物污染?！吨腥A人民共和國藥典》2010版[16]規(guī)定，不含藥材原粉的口服給藥制劑霉菌和酵母菌數(shù)不得超過100 cfu/g，而《中華人民共和國藥典》2015版[17]及2020版[15]規(guī)定，霉菌和酵母菌總數(shù)為102cfu/g，可接受的最大菌數(shù)為200 cfu/g；從標(biāo)準(zhǔn)的修訂過程中可以看出，對(duì)微生物污染的控制越來越受重視，是確保藥品質(zhì)量安全性及有效性的第一關(guān)口，相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)須引起高度重視。同時(shí)，藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)，必須嚴(yán)格按照藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范、藥品經(jīng)營質(zhì)量管理規(guī)范及藥品管理法的要求，加大監(jiān)管力度，提高監(jiān)管效能，保障人民群眾安全用藥。