拜顫停復方對MPP+誘導SH－SY5Y細胞自噬及凋亡機制研究

高鑫，王一晴，盧芳，陳平平，劉樹民

（黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種常見的神經退行性疾病，以靜止性震顫、運動遲緩和肌強直三聯征為特點。西醫(yī)采用左旋多巴和外科手術的方法治療，但會產生毒副作用和神經損傷后遺癥。中醫(yī)學認為，肝腎陰血虧虛日久則筋失濡養(yǎng)，造成機體痙攣顫動，采用方藥隨證加減治療PD，取得很好的臨床療效。本研究選擇的拜顫停復方是由臨床治療PD 的經驗方復元平顫寧［1］精制而得，由刺五加、白芍及鉤藤三味中藥組合而成。方中刺五加益氣補腎為君藥；白芍可養(yǎng)血柔肝為臣藥，助君藥滋養(yǎng)肝腎；鉤藤清熱平肝為佐藥。三藥合用，達到滋補肝腎、補氣養(yǎng)血之療效，可謂“標本兼治”，前期研究表明其對PD療效顯著［2－3］。

現代研究表明，PD 的發(fā)生與細胞自噬和凋亡平衡失調有關［4－5］。自噬和凋亡的正常進行可以使相關通路在腦組織中處于激活狀態(tài)，從而促進神經細胞正常發(fā)育過程［6］。那么拜顫停復方的神經保護及治療作用機理與調節(jié)自噬與凋亡過程是否有關？基于此問題，本研究選擇采用MTT 法檢測細胞活性，明確拜顫停復方的神經保護作用；采用流式細胞技術和熒光染色技術觀測細胞自噬、凋亡和死亡程度，明確用藥前后細胞自噬、凋亡和死亡方式變化；采用蛋白質印跡法檢測PD 模型細胞中自噬與凋亡蛋白含量變化，明確自噬凋亡信號蛋白表達在PD中的情況，揭示拜顫停復方的神經保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

SH－SY5Y 細胞株，購于中國科學院上海細胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)液（含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10%胎牛血清），置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2 實驗藥物

1.2.1 藥材

刺五加藥材（批號：170634）購自黑龍江省五常市世一堂中藥材有限公司，為五加科植物刺五加［Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms］的干燥根和根莖或莖；白芍藥材（批號：17052594）購自安徽亳州市藥材總公司，為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根；鉤藤藥材（批號：17053549）購自貴州劍河縣國鴻中藥材有限責任公司，為茜草科植物鉤藤［Uncaria rhynchophylla（Mia.）Miq.Ex Havil.］的干燥帶鉤莖枝。均經黑龍江中醫(yī)藥大學中藥資源學教研室王振月教授鑒定，符合2015 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

1.2.2 制備方法

本研究使用的拜顫停復方中各味中藥的最佳配伍比例參考課題組前期實驗所得［2－3］，最佳配伍比例為：刺五加提取物∶白芍提取物∶鉤藤提取物= 54.0∶45.0∶82.5。拜顫停復方按照《中華人民共和國藥典》規(guī)定的每日最高用量進行換算。實驗室自行制備拜顫停復方藥液，樣品保存在黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院中藥藥性理論研究室（20190702）。

小鼠給藥量= 生藥量（g/60 kg）×9.1×出膏率

1.3 試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：H20010304）；胰蛋白酶（美國Hyclone 公司，批號：H107－50）；胎牛血清（美國Hyclone 公司，批號：H7589）；MPP+（北京謹明生物科技有限公司，批號：2018041023）；吖啶橙染色劑（西安百螢生物科技有限公司，批號：160110005）；SDS－PAGE 凝膠配制試劑盒（美國Biosharp 公司，批號：BL508A）；Tween 20（德國BIOFROXX 公司，批號：1247ML100）；Western blot一抗二抗去除液（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P00258）；Albumin Bovine V（美國Amresco 公司，批號：0332）；飛克特超敏ECL 發(fā)光液（Meilunbio，批號：MA0186－L）；Beclin（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－1353R）；LC3B（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：18725－1－AP）；p53（英國abcam公司，批號：Ab26）；AMPK（英國abcam 公司，批號：Ab80039）；mTOR（英國abcam 公司，批號：Ab2732）；Bax（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－0127R）；Bcl－2（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－0032R）；Casepase－3（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－0081R）；GAPDH（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs－10900R）。

1.4 儀器

HF90 CO2培養(yǎng)箱（香港力康生物醫(yī)療科技控股集團）；熒光顯微鏡（日本奧林巴斯有限公司）；KDC－160HR 高速冷凍離心機（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司）；UV－2450 紫外分光光度計（日本島津）；DP72 顯微攝像系統(tǒng)（日本奧林巴斯有限公司）；Motic Med 6.0數碼醫(yī)學圖像分析儀（北京麥克奧迪圖像技術有限公司）；全自動樣品快速研磨儀（上海凈信科技）；全波長讀數儀（Thermo）；Trans－blot 轉膜儀（Thermo）；Pharos FX 激光成像系統(tǒng)（Bio－Rad）；Guava easycyte 流式細胞儀。

1.5 方法

1.5.1 實驗分組及給藥

將SH－SY5Y細胞分為正常對照組、模型對照組、拜顫停復方組和3－MA組。拜顫停復方組的給藥劑量為193.6 μg/mL（課題組前期實驗篩選所得的最佳劑量［7－9］），且拜顫停復方對細胞的毒性作用甚微，可以忽略不計［10］。正常對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，其余各組均加入0.437 mmol/L 的MPP+干預。2 h 后，拜顫停復方組加入193.6 μg/mL濃度拜顫停藥液，3－MA組加入193.6 μg/mL拜顫停藥液和5 mmol/L 3－MA試劑。

1.5.2 PD細胞模型活性實驗

選擇MTT 法檢測細胞活性。96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個細胞，于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中以37 ℃培養(yǎng)24 h，至細胞單層鋪滿孔底。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，靜置于細胞培養(yǎng)箱2 h 后吸去上清液，加入Formazan 溶解液150 μL，水平搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶標儀上測定各孔光吸收值，選擇波長為490 nm，記錄結果并根據公式計算細胞活性。

細胞活性（%）=（給藥組OD值－空白組OD值）/（模型組OD值－空白組OD值）×100%

1.5.3 PD細胞模型凋亡實驗

依據Annexin V－FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明，使用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。

1.5.4 PD細胞模型自噬實驗

選擇吖啶橙染色法。取各組對數生長期細胞，加入吖啶橙（1 mg/mL）避光染色15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。每張片取5 個視野，計數5 個視野中每100 個細胞中染色陽性（有自噬囊泡）的細胞數，進而計算吖啶橙染色自噬囊泡細胞數目的百分數。

1.5.5 PD細胞模型自噬與凋亡蛋白實驗

選擇Western blot 檢測方法。上樣后連接電泳儀，起始電壓為80 V，當溴酚藍跑到分離膠后，提高電壓到120 V，至溴酚藍達分離膠底部，電泳結束。海綿和PVDF 膜用轉移緩沖液浸泡，去掉濃縮膠后與其一起放入濕轉電泳槽中，連接電泳儀，選擇電壓110 V，電泳100 min。電泳完畢后將膜浸于5%封閉液中，置于搖床，室溫封閉2 h。封閉結束結合一抗，然后結合二抗，最后將膜浸于ECL發(fā)光液中，避光顯色2 min，置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描。

2 結果

2.1 對PD細胞模型活性的影響

與正常對照組比較，模型對照組細胞活性極顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，拜顫停復方組細胞活性顯著升高（P＜0.05），3－MA 組細胞活性無顯著變化（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組PD細胞模型活性比較（±s）

表1 各組PD細胞模型活性比較（±s）

注：與正常對照組比較，##P ＜0.01；與模型對照組比較，*P ＜0.05。

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2.2 對PD細胞模型凋亡的影響

從流式細胞FITC/PI散點圖可以看出，正常對照組散點主要集中在3 區(qū)，而且由于操作等原因導致的機械致死細胞很少。模型對照組散點主要集中在2 區(qū)和4 區(qū)，凋亡早期、凋亡晚期和壞死細胞數量較多；3區(qū)散點較少，活細胞較少。與模型對照組比較，拜顫停復方組散點主要分布于3區(qū)和4區(qū)，活細胞數量較模型對照組提高且明顯，凋亡早期細胞數量較模型對照組減少；2 區(qū)幾乎沒有散點分布，晚期凋亡或壞死細胞很少。與模型對照組比較，3－MA 組散點主要分布于2 區(qū)和4 區(qū)，樣本細胞凋亡程度高；3 區(qū)散點零星分布，活細胞數量少。見圖1。

圖1 各組PD細胞模型凋亡情況

2.3 對PD細胞模型自噬的影響

吖啶橙染色結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組黃綠色熒光數量較多，自噬囊泡數顯著降低（P＜0.05），自噬程度高；拜顫停復方組黃綠色熒光數量回調，自噬囊泡數顯著升高（P＜0.05），即拜顫停復方組含有自噬囊泡細胞數量回調；3－MA 組黃綠色熒光數量較少，自噬囊泡數差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），即3－MA 組含有自噬囊泡數量與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2和圖2。

圖2 各組PD細胞模型自噬情況

表2 各組PD細胞模型自噬囊泡數目比較（±s）

表2 各組PD細胞模型自噬囊泡數目比較（±s）

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05；與模型對照組比較，*P ＜0.05。

組別正常對照組模型對照組拜顫停復方組3－MA組自噬囊泡數目（%）30.54±2.20 6.48±1.94#22.96±1.18*5.21±1.23

2.4 對PD細胞模型自噬、凋亡蛋白的影響

利用蛋白質免疫印跡法觀察拜顫停復方對細胞自噬及凋亡的影響。與正常對照組比較，模型對照組Bax蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組Bax蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組Bax蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組Bcl－2 蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組Bcl－2顯著升高（P＜0.05），3－MA組Bcl－2蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組Caspase蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組Caspase 蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組Caspase 蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組LC3B 蛋白顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組LC3B蛋白顯著升高（P＜0.05），3－MA組LC3B蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組AMPK蛋白顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組AMPK 蛋白顯著降低（P＜0.05），3－MA 組AMPK 蛋白差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組mTOR 蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組mTOR 蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組mTOR蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組Beclin蛋白含量顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組Beclin蛋白含量顯著升高（P＜0.05），3－MA 組Beclin蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與正常對照組比較，模型對照組p53蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，拜顫停復方組p53蛋白含量顯著降低（P＜0.05），3－MA 組p53蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

表3 各組PD細胞模型自噬、凋亡蛋白表達量比較（±s，%）

表3 各組PD細胞模型自噬、凋亡蛋白表達量比較（±s，%）

注：與正常對照組比較，#P ＜0.05；與模型對照組比較，*P ＜0.05。

組別正常對照組模型對照組拜顫停復方組3－MA組Bax 51.94±2.33 128.00±1.47#79.28±1.72*105.63±2.12 Bcl－2 125.38±1.29 88.23±1.69#110.41±2.42*79.58±2.57 Caspase 51.42±1.83 110.47±1.86#63.63±2.42*92.13±2.17 LC3B 98.27±1.71 45.83±2.44#103.73±1.42*71.68±1.98 AMPK 67.42±1.43 75.98±1.32#61.45±2.71*79.32±1.09 mTOR 73.71±2.48 116.85±2.23#79.01±1.42*121.33±1.92 Beclin 125.31±1.39 72.91±1.12#106.92±1.57*79.38±1.04 p53 75.92±2.33 106.02±1.13#79.47±2.19*89.48±1.87

圖3 各組PD細胞模型自噬、凋亡蛋白情況

3 討論

細胞自噬和凋亡的關系是錯綜復雜的，在病毒、感染和饑餓等應激條件下，細胞自噬被誘導發(fā)生，當持續(xù)應激導致細胞病變無法修復時，細胞凋亡則被激活，自噬和凋亡過程中涉及的關鍵調節(jié)蛋白的雙重調節(jié)作用成為近年來研究兩者關系的重點［11－12］。那么拜顫停復方治療PD 的機制是否是通過調控細胞自噬與凋亡實現的？基于此，本課題組展開了相關研究。

PD 細胞模型活性影響的實驗中，拜顫停復方可以減弱MPP+對SH－SY5Y 細胞的毒性作用，從而保護神經元；3－MA 組細胞活性低于拜顫停復方組，與模型對照組類似，推測拜顫停復方保護神經元的作用是通過促進細胞自噬實現的，當自噬被主動抑制時，拜顫停復方的作用效果減弱。

PD 細胞模型凋亡的影響實驗與吖啶橙染色實驗中，模型對照組熒光幾乎淬滅，總體凋亡趨勢明顯，自噬程度低，符合MPP+對細胞的毒性損傷［13－14］。拜顫停復方組自噬程度提高，凋亡被抑制，反映了其神經保護作用。3－MA 組熒光淬滅程度與模型組相似，說明抑制細胞自噬會降低拜顫停復方的作用效果，推測復方主要通過促進自噬發(fā)揮作用。

為深入探索拜顫停復方調控的自噬和凋亡相關蛋白以及具體的調控方式進行了自噬、凋亡蛋白影響實驗。Bax 和Bcl－2 是自噬與凋亡主要的活性調控因子，Bax 被激活會從胞漿中轉移到線粒體膜上，導致細胞色素的釋放，從而引起細胞凋亡。Bax 相對量多于Bcl－2 時，細胞凋亡被促進，反之則被抑制［15］。Caspase 蛋白與細胞凋亡密切相關，Caspase－3 直接作用于內質網凋亡途徑和內源凋亡途徑，激活后凋亡將不可逆轉［16］；Caspase－9 會在外源凋亡途徑中誘導凋亡的發(fā)生，刺激線粒體釋放細胞色素C 從而使細胞凋亡［17］；故Caspase－3 和Caspase－9 會以內外聯動的方式加速細胞凋亡。LC3B 是自噬小體膜蛋白的一種亞型，它是可檢測自噬發(fā)生的標志性蛋白［18－19］，Beclin 是與自噬調控相關的關鍵因子，ULK1的激酶通過磷酸化Beclin，誘導了細胞自噬發(fā)生［20］，這兩種因子在機體內的表達量與自噬呈正相關。AMPK/mTOR/p53 是機體一條調控自噬－凋亡的重要途徑，激活此通路可延長細胞存活周期，使凋亡得到抑制［21－22］。其中，AMPK 能夠通過切斷細胞能量供應使其凋亡。p53 激活后會通過誘導AMPK 亞基的表達調節(jié)誘導凋亡。同時隨著p53 的增高，AMPK 的磷酸化水平被促進，mTOR 的磷酸化水平受到抑制［23－24］，促自噬抑凋亡。因此，病理模型中能夠促進自噬的蛋白如Bcl－2、LC3B、AMPK、Beclin、p53明顯下調，促進凋亡的蛋白如Bax、Caspase、mTOR 明顯上調；經拜顫停復方干預后自噬和凋亡蛋白變化趨勢相反。自噬被抑制后，復方抑制凋亡作用減弱。

綜上所述，拜顫停復方通過促進神經元自噬，干預了自噬與凋亡平衡，從而反饋性抑制凋亡，實現神經保護作用，從而治療PD。本研究從自噬和凋亡的角度揭示拜顫停復方防治PD 的新機制，為PD 的治療提供新的靶點和療法。