硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色法檢測(cè)幽門螺旋桿菌效果評(píng)價(jià)

鄧士杰，喻朝霞

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶市第一人民醫(yī)院 病理科，安徽 安慶 246000)

研究發(fā)現(xiàn)幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylorus，Hp)感染與80%的胃潰瘍和90%的十二指腸潰瘍有關(guān)[1],各個(gè)年齡段的人群均有感染[2]，在發(fā)展中國(guó)家感染率為50.8%，發(fā)達(dá)國(guó)家感染率為34.7%[3]。我國(guó)人口眾多，感染基數(shù)大，因此必須重視Hp的早診早治。上級(jí)醫(yī)院開(kāi)展較多的是免疫組織化學(xué)法，而Giemsa法和硼酸亞甲藍(lán)法仍然是基層醫(yī)院較為經(jīng)濟(jì)可靠的檢測(cè)方法[4-5]。硼酸亞甲藍(lán)法染色后菌體淡染呈針尖樣，點(diǎn)狀排列，需要在高倍鏡下仔細(xì)觀察，大量閱片后易引起視覺(jué)疲勞。如果將硼酸鈉替換硼酸配置染液同時(shí)加入3%冰醋酸，筆者發(fā)現(xiàn)菌體顏色較深，易于分辨。本研究擬對(duì)兩種染色方法進(jìn)行比較，探討硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)法在Hp檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本選取與分組 收集安慶市第一人民醫(yī)院病理科2019～2020年胃竇部活檢Hp確診標(biāo)本62例，性別和年齡不限。根據(jù)Giemsa染色情況和《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)2017.上?！穂6]將確診標(biāo)本分成輕度感染組(32例)、中度感染組(19例)和重度感染組(11例)，每組連續(xù)切片2張，分別行硼酸亞甲藍(lán)染色和硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色。

1.2 主要試劑及設(shè)備 亞甲基藍(lán)(比克曼生物)，硼酸與硼酸鈉(國(guó)藥集團(tuán))，蒸餾水，冰醋酸，徠卡2235切片機(jī)，萊卡sp300脫水機(jī)，奧林巴斯顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 硼酸亞甲藍(lán)法：蒸餾水400 mL中加入硼酸2 g，攪拌至完全溶解，加入美藍(lán)4 g，充分?jǐn)嚢杌旌虾筮^(guò)濾，盛入避光密封瓶，置于4℃冰箱保存。硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)法：蒸餾水400 mL中加入硼酸鈉2 g，攪拌至完全溶解，加入美藍(lán)4 g，充分?jǐn)嚢杌旌虾筮^(guò)濾，盛入避光密封瓶，加入3%冰醋酸5 mL，室溫保存。

1.3.2 Hp感染程度判讀標(biāo)準(zhǔn) 按《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見(jiàn)2017.上?！穂6]判讀Hp，觀察胃黏膜黏液層、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮表面的Hp。無(wú)：特殊染色片上未見(jiàn)Hp；輕度：偶見(jiàn)或小于標(biāo)本全長(zhǎng)1/3有少數(shù)Hp；中度：Hp分布超過(guò)標(biāo)本全長(zhǎng)1/3而未達(dá)2/3或連續(xù)、薄而稀疏地存在于上皮表面；重度：Hp成堆存在，基本分布于標(biāo)本全長(zhǎng)。

1.3.3 染色步驟 硼酸亞甲藍(lán)法：切片脫蠟至水，硼酸亞甲藍(lán)染液2 min，蒸餾水洗10 s，烘干，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)法：切片脫蠟至水，硼酸鈉亞甲藍(lán)染液15 s，水洗3 s，95%乙醇分化2 s，水洗3 s，快速脫水10 s，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用矯正配對(duì)χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法染色效果 圖1A顯示，硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)400倍鏡下，Hp呈藍(lán)色，染色較深，菌體清晰分布于胃小凹中；圖1B顯示，硼酸亞甲藍(lán)染色400倍鏡下，Hp呈淡藍(lán)色，菌體模糊不清。

圖1 硼酸鈉-冰醋酸、硼酸亞甲藍(lán)染色(10×40)

2.2 兩種染色方法在不同分組中的檢出率 重度組：兩種染色方法檢出率均為100%(11/11)。中度組：硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色檢出率為100%(19/19)；硼酸亞甲藍(lán)染色檢出率為89.47%(17/19)。輕度組：硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)檢出率為90.63%(29/32)；硼酸亞甲藍(lán)染色檢出率為68.75%(22/32)，且硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)檢出率高于硼酸亞甲藍(lán)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩種染色方法在3組中染色情況比較

3 討論

Hp檢測(cè)方法較多，尿素呼氣試驗(yàn)方法(urea breath test,UBT)快捷，適用于兒童和孕婦[7]，但是價(jià)格較貴；N15-尿氨排出試驗(yàn)與UBT原理相同，易受肝腎功能[8]和食用益生菌影響[9]而出現(xiàn)假陰性結(jié)果；血清學(xué)檢查具有較高的靈敏度和特異度，但Hp根除治療后抗體能存在6個(gè)月以上[10]，因此血清學(xué)檢查不能反映現(xiàn)癥感染。組織學(xué)檢測(cè)被認(rèn)為是診斷Hp的金標(biāo)準(zhǔn)，且與胃黏膜炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)[11]。目前臨床病理Hp檢查方法使用較多的是免疫組織化學(xué)法和特殊染色法，而本研究使用硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色成本低廉，方法簡(jiǎn)單快捷，易普及。

從染色時(shí)間看，硼酸亞甲藍(lán)染色時(shí)間>2 min，而硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色時(shí)間僅為33 s，這將大大減輕技術(shù)員的工作負(fù)擔(dān)。硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染液時(shí)長(zhǎng)至少需要15 s，尤其輕度感染菌體較少的情況下，如果時(shí)間過(guò)短染液結(jié)合不牢，經(jīng)過(guò)95%乙醇洗脫和下一步酒精梯度脫水后使得菌體染色變淡，容易出現(xiàn)假陰性。硼酸亞甲藍(lán)染液染色時(shí)長(zhǎng)跟菌體著色深淺有關(guān)，過(guò)長(zhǎng)的染色時(shí)間使得染液過(guò)多結(jié)合于菌體和胃黏膜表面，由于直接烘干，背景常有透明顆粒和藍(lán)色顆粒，嚴(yán)重影響Hp的判讀。硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色經(jīng)95%酒精洗去黏膜黏液層、表面上皮、小凹上皮和腺管上皮多余染液，使得菌體清晰可辨。

Hp中度感染組和重度感染組兩種染色方法均具有較高的檢出率，可能與胃黏膜內(nèi)菌體數(shù)量較多，容易檢出有關(guān)。輕度組中硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色檢出率高于硼酸亞甲藍(lán)染色，筆者認(rèn)為可能原因是弱堿性的硼酸鈉配置的染液易與呈弱酸性的Hp菌體表面結(jié)合，不易被95%酒精洗脫使菌體更加清晰，即使胃黏膜內(nèi)有少量的Hp菌體也容易被檢出。兩種檢測(cè)方法在輕度感染組檢出率都不同程度降低，可能原因是蠟塊經(jīng)過(guò)多次深切后，殘存Hp菌體較少，使得兩種染色方法的檢出率下降。通過(guò)初次切片保留較多的Hp菌體和提高樣本量來(lái)進(jìn)一步觀察兩種染色方法在輕度感染組的染色效果，這將是我們下一步的工作重點(diǎn)。

綜上所述，雖然兩種染色方法都能滿足常規(guī)診斷需要，但是硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色無(wú)論染色時(shí)間還是染色效果均優(yōu)于硼酸亞甲藍(lán)染色，基層醫(yī)院可以結(jié)合自身實(shí)際情況采用硼酸鈉-冰醋酸亞甲藍(lán)染色來(lái)提高Hp的檢出率。