NRP1和TGF-β1在涎腺腺樣囊性癌組織中的表達與意義

楊永超，安 峰，王鐘華

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院 口腔科，河北 張家口 075000)

涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是口腔頜面部涎腺中常見的一種惡性腫瘤，惡性程度及發(fā)生率均較高，其發(fā)病率僅低于黏液表皮樣癌，腫瘤的發(fā)病部位最常見的是上腭部的小涎腺，其次是腮腺和下頜下腺；臨床上如發(fā)現(xiàn)舌下腺腫瘤發(fā)生惡變，應(yīng)首先考慮為SACC。SACC具有兩個顯著的腫瘤生物學特征：①血行轉(zhuǎn)移高而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低；②神經(jīng)侵襲率極高。相關(guān)報道SACC的血行轉(zhuǎn)移率高達40%，肺部是SACC血行轉(zhuǎn)移最主要的目標器官；臨床上發(fā)現(xiàn)SACC的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較低[1]。對于SACC患者而言，其血行轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯的生物學特征對癌癥患者的功能保留及遠期預(yù)后極為不利。國內(nèi)外大量學者一直從相關(guān)基因、血管生成方向致力于SACC生物學特征的研究。

NRP1是Neuropilin蛋白家族中的重要成員之一，是一種調(diào)控胚胎組織發(fā)育以及腫瘤進展的跨膜糖蛋白，研究發(fā)現(xiàn)NRP1被上調(diào)時，可調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，并以此促進腫瘤細胞不斷進行有絲分裂，具有刺激腫瘤不斷生長并發(fā)生浸潤，促進周圍血管生成等生物學特征。TGF-β1(transforming growth factor β1)是轉(zhuǎn)化生長因子β家族中重要成員之一，在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移浸潤和逃避免疫控制過程中通過多種信號通路發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化SABC技術(shù)檢測NRP1和TGF-β1在SACC組織中、涎腺正常組織中的表達水平，分析兩者與SACC之間的關(guān)系，并研究兩者之間是否存在相關(guān)性，探尋其在SACC發(fā)生發(fā)展中可能存在的機制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 實驗組的標本采集 收集2013年6月～2020年12月于河北北方學院附屬第一醫(yī)院住院行手術(shù)切除治療的51例患者的標本蠟塊。所有標本術(shù)后均經(jīng)常規(guī)病理診斷為SACC。所收集病例的臨床資料詳實且術(shù)前3個月內(nèi)未接受相關(guān)抗癌治療(放射、化學、靶向治療等)。對標本按照性別、年齡(38～75歲，中位年齡55歲)、組織學(2005年制定的病理學分類標準)、臨床分期(AJCC唾液腺癌TNM分類分期，2017)、頸淋巴結(jié)情況、神經(jīng)系統(tǒng)情況進行分類，其中：男27例，女24例；年齡≤55歲26例，>55歲25例；管狀/篩孔型30例，實性型21例；Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期27例；侵犯頸淋巴結(jié)14例，未侵犯頸淋巴結(jié)37例；侵犯周圍神經(jīng)22例，未侵犯周圍神經(jīng)29例。

1.1.2 對照組的標本采集 取手術(shù)中切除的20例涎腺正常組織作為本實驗的對照標本。

1.2 試劑 兔抗人NRP1親和抗體(武漢青木生物技術(shù)有限公司)，兔抗人TGF-β1親和抗體(上海雅吉科技有限公司)，SABC檢測試劑盒、DAB試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 免疫組化 所有組織標本均以4 μm的標準厚度，制作出實驗切片。實驗切片先進行脫蠟至水，然后熱修復(fù)法行抗原修復(fù)：放入枸櫞酸鹽緩沖液中加熱。修復(fù)完成后用PBS緩沖液沖洗5 min，共2次。一抗NRP1(1∶200)、TGF-β1(1∶100)，SABC法染色，蘇木精復(fù)染、脫水封片。

1.4 結(jié)果判定 根據(jù)免疫反應(yīng)評分法[2](immunreaktiven score，IRS)對本次實驗結(jié)果進行綜合評分。首先統(tǒng)計每張染色切片中陽性細胞的個數(shù)及總細胞數(shù)，計算其陽性率(以PP表示，數(shù)據(jù)采用百分制)；然后依據(jù)細胞顏色判斷實驗切片中細胞的染色強度(以SI表示)，兩者相乘計算出最終得分(IRS=PP×SI)。用200倍的高倍鏡頭在每個實驗切片中任意選取10個不連續(xù)視野，計算出陽性細胞百分比，多次實驗取平均值：無陽性細胞PP計0分，03表示高表達，≤3表示低表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。NRP1、TGF-β1在各組別間的表達采用χ2檢驗，NRP1、TGF-β1間關(guān)聯(lián)性采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NRP1、TGF-β1在SACC及涎腺正常組織中的表達 NRP1、TGF-β1在SACC及涎腺正常組織的陽性表達產(chǎn)物主要集中于細胞的胞質(zhì)和胞膜中。見圖1。

A.NRP1；B.TGF-β1。

2.2 NRP1、TGF-β1在SACC組織中的表達情況及與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián) SACC組織中NRP1、TGF-β1的陽性細胞表達率高于涎腺正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NRP1、TGF-β1在SACC組織中的表達水平與患者性別、年齡相關(guān)性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與腫瘤的組織學類型、臨床分期、腫瘤細胞是否侵犯到頸部淋巴結(jié)以及是否侵犯到周圍神經(jīng)有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 SACC組織及涎腺正常組織中NRP1、TGF-β1的表達情況及與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)[n(%)]

2.3 SACC組織中NRP1和TGF-β1關(guān)聯(lián)性 結(jié)果顯示，NRP1和TGF-β1在SACC組織中的表達呈正相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 NRP1、TGF-β1在SACC中的表達關(guān)系

3 討論

NRP1是神經(jīng)纖毛蛋白同源物中的一種多功能跨膜蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，NRP1對神經(jīng)元和心血管系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。NRP1在癌癥中可與血管相關(guān)因子作用，可與血管內(nèi)皮生長因子A直接作用形成復(fù)合物VEGFA，進而促進腫瘤細胞的生長和侵襲，促使腫瘤惡化[3]；還可與血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)作用，增強腫瘤增殖區(qū)域的血管生成。在口腔癌癥中，沈耀川等[4]使用兩種方法證實抑制NRP1功能后，舌癌TCaSll3細胞的增殖能力均顯著降低，而凋亡率則顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)NRP1在SACC組織內(nèi)的陽性率(62.7%)高于口腔涎腺正常組織(35.0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示NRP1可能促進SACC的發(fā)生。在SACC中NRP1與年齡、性別相關(guān)性均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在本實驗中我們可以發(fā)現(xiàn)，NRP1與組織學類型、臨床分期、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無神經(jīng)侵犯均相關(guān)(P<0.05)，提示SACC中的NRP1可能促進了腫瘤的惡化程度。

TGF-β1是TGF-β超家族中重要的亞型，在人體發(fā)育、病變過程中廣泛地參與許多生物過程，主要作用包含調(diào)節(jié)各個階段的胚層生長發(fā)育；促進細胞外基質(zhì)合成、上皮組織細胞分裂增長；改變機體免疫應(yīng)答等[5]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤的惡變、侵襲機制中TGF-β1發(fā)揮著截然不同的兩種作用：在腫瘤早期形成階段，TGF-β1可作為腫瘤生長的抑制因子，遏制癌前上皮細胞的有絲分裂，減小增殖；隨著腫瘤細胞數(shù)量的逐漸增長，腫瘤細胞的細胞遺傳和DNA甲基化也隨之發(fā)生改變，TGF-β1逐漸失去對腫瘤細胞的抑制作用，當抑制作用無法抵制腫瘤細胞增長時，腫瘤細胞進入優(yōu)勢生長階段；在腫瘤的最后階段，TGF-β1反而可通過多種信號傳導(dǎo)，促使病變細胞發(fā)生從上皮狀態(tài)向間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)換，可使腫瘤組織的病變細胞轉(zhuǎn)移速度加快，周圍血管內(nèi)皮細胞激活、增殖等，為腫瘤增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移提供有利的生長環(huán)境，最終TGF-β1變成腫瘤癌變過程中的促進因子。本研究表明，TGF-β1在SACC組織內(nèi)的陽性率(58.8%)高于口腔涎腺正常組織(30.0%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示TGF-β1與SACC的發(fā)生相關(guān)。本次研究我們在SACC中還發(fā)現(xiàn)，TGF-β1與年齡、性別相關(guān)性無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與組織學類型、臨床分期、有無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無神經(jīng)侵犯均相關(guān)(P<0.05)，表明TGF-β1與SACC的惡化、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示其可作為判斷病情進展的依據(jù)。

綜合本實驗SACC組織中NRP1和TGF-β1的表達關(guān)系發(fā)現(xiàn)：兩者在SACC組織中的表達呈正相關(guān)。有研究認為：在腫瘤細胞獲得侵襲及轉(zhuǎn)移的生物過程中，當腫瘤細胞的連接與極性喪失，獲得高遷移能力時，腫瘤開始發(fā)生EMT；然而在EMT過程中，TGF-β1被認為是最有效的協(xié)調(diào)因子之一；NRP1是一種多功能的共受體，具有結(jié)合不同蛋白家族的能力，在EMT過程中NRP1可調(diào)節(jié)其相關(guān)的信號通路。因此，推測NRP1可結(jié)合并激活潛在形式的TGF-β1，可作為TGF-β1的受體，在多種細胞中已被證明NRP1增強TGF-β1的誘導(dǎo)反應(yīng)能力[6]。另有研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β1在腫瘤快速增殖過程中，通過多種信號傳導(dǎo)促進腫瘤增殖區(qū)域的血管形成，因此相關(guān)學者關(guān)注到TGF-β1與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有著密切的聯(lián)系[7]。目前認為VEGF是一種促進血管快速生長的因子，能夠刺激血管內(nèi)皮細胞增殖、形成新生血管。當VEGF在腫瘤組織中表達活躍時，血管通透性增強，導(dǎo)致腫瘤細胞向遠處組織侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。已發(fā)現(xiàn)TGF-β1能促進VEGF的表達[9]；

而血管內(nèi)皮細胞中可以檢測到NRP1的表達，NRP1結(jié)合VEGFA，可促進血管生成[10]，由此研究推測，NRP1可與TGF-β1相互作用，促進腫瘤的高血行轉(zhuǎn)移率。最終我們可以推測得出NRP1可能通過一種或者多種路徑與TGF-β1共同作用，本研究結(jié)果也證實此推測，在SACC組織中NRP1可能與TGF-β1共同作用，促進腫瘤血管形成，加速了腫瘤的發(fā)展。本實驗在SACC中研究兩者的關(guān)系可為指導(dǎo)腫瘤的預(yù)后、治療提供相關(guān)依據(jù)。