丁苯酞對膿毒癥大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮的保護作用

陳雪梅，李 慧，方 瑩，孫貝貝，王 靜，陳雪祎，王海華

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.生理學(xué)教研室；2.藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

膿毒癥是由感染引發(fā)嚴重多器官功能障礙的危重病癥，病死率高居不下[1]。膿毒癥引起的抗感染和器官衰竭治療已有很大的進步，但高昂的治療費用和不佳的預(yù)后給患者家庭和社會帶來嚴峻的挑戰(zhàn)。在膿毒癥期間，血管功能障礙是其重要的病理生理變化，可引起組織缺血缺氧、器官功能障礙甚至導(dǎo)致機體功能嚴重衰竭[2]。微血管是機體的主要阻力血管，膿毒癥首先引發(fā)其結(jié)構(gòu)功能的損傷，直接或間接地影響疾病的轉(zhuǎn)歸[3-4]，深入研究膿毒癥微血管功能變化及其機制，可尋找保護性措施。

丁苯酞(N-butylphthalide,NBP)主要用于改善急性缺血性腦卒中造成的精神功能損傷[5]，有研究證實，其還具有控制炎癥反應(yīng)、減輕線粒體受損、調(diào)節(jié)微循環(huán)等作用[6]。本研究通過建立膿毒癥大鼠模型，觀察不同濃度的NBP對膿毒癥大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮功能的作用及其機制，為膿毒癥及其并發(fā)癥的防范和治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只體質(zhì)量(240±10)g雄性SPF級大鼠，許可證號SCXK(魯)20190003。

1.2 試劑與器材 NBP注射液(恩必普藥業(yè)公司)；腎上腺素(PE，遠大醫(yī)藥公司)；乙酰膽堿(ACh，上海麥克林公司)；硝普納(SNP，廣東宏遠公司)；一氧化氮合酶(NOS)抑制劑(L-NAME,sigma公司)；可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(SGC)抑制劑(NS-2028,sigma公司)；微血管張力測定儀(danish myo technology A/S公司)。

1.3 分組及血流動力學(xué)指標 40只大鼠隨機分為假手術(shù)(SHAM)組、膿毒癥(CLP)組、丁苯酞低劑量干預(yù)(CLP+NBP-L)組(NBP 4 mg/kg)、丁苯酞高劑量干預(yù)(CLP+NBP-H)組(NBP 6 mg/kg)，各10只。SHAM組僅開關(guān)腹處理，CLP組用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立模型，CLP+NBP-L組和CLP+NBP-H組于術(shù)后6、12、24 h腹腔注射藥物，24 h后麻醉大鼠，行右頸總動脈插管，測左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)[7-9]。

1.4 大鼠血清中IL-6和TNF-α水平檢測 采血靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清液，保存于-80℃冰箱。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作。

1.5 腸系膜動脈血管結(jié)構(gòu)的觀察 將腸系膜動脈固定、脫水、包埋、切片、HE染色，對比鏡下各組血管組織結(jié)構(gòu)的區(qū)別，用Image J軟件分析管壁厚度/管腔半徑(WT/LR)的變化[10]。

1.6 腸系膜動脈舒張功能檢測 將血管環(huán)標準化后[11]，用60 mmol/L的高鉀溶液分兩次預(yù)收縮血管，兩次收縮的張力均>3 mN且收縮幅度差別<10%時，說明血管功能正常[12]。加入1×10-5mol/L的PE，待血管張力平穩(wěn)后添加1×10-4mol/L的ACh，血管舒張>60%，說明血管內(nèi)皮完整，可用于后續(xù)實驗[13-14]。加入濃度為1×10-5mol/L的PE，當(dāng)收縮達到平臺期時依次加入終濃度為1×10-9～1×10-4mol/L的ACh/SNP(圖1)，觀察各組的腸系膜動脈中，不同濃度的ACh/SNP的舒張強度(△ACh/SNP=PE的收縮平臺值-ACh/SNP舒張反應(yīng)峰值)和舒張效應(yīng)(舒張強度/PE收縮強度的百分比)，并作出劑量-效應(yīng)曲線。浴槽中分別孵育L-NAME、NS-2028 30 min(1×10-4mol/L)后再進行上述操作。

圖1 腸系膜動脈環(huán)舒張效應(yīng)檢測

1.7 腸系膜中eNOS活性及NO含量的檢測 腸系膜組織勻漿后2 500 r/min離心10min，吸取上清液，分別運用酶聯(lián)免疫吸附法、硝酸還原法測定腸系膜動脈組織中eNOS活性和NO含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸腔及心功能變化 SHAM組大鼠精神狀況佳，腸腔無病理改變，心功能正常。CLP組大鼠精神萎靡、腸腔粘連壞死，有惡臭味和血性液體，LVEDP和±dp/dtmax等心功能參數(shù)下降(P<0.05)，表明CLP大鼠建模成功(圖2，表1)。CLP+NBP-L組和CLP+NBP-H組較CLP組的LVEDP、±dp/dtmax參數(shù)恢復(fù)(P<0.05)(表1)。表明NBP對膿毒癥大鼠的腹腔炎癥狀況有所改善。

A.SHAM組；B.CLP組；C.CLP+NBP-L組；D.CLP+NBP-H組。

表1 大鼠心功能變化

2.2 大鼠血清炎性因子變化 CLP組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平較SHAM組增高(P<0.05)，CLP+NBP-L組和CLP+NBP-H組較CLP組減少(P<0.05)(表2)。表明膿毒癥能引發(fā)機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，而NBP可減輕膿毒癥引起的這種反應(yīng)。

表2 大鼠血清炎性因子變化

2.3 大鼠腸系膜動脈結(jié)構(gòu)變化 HE染色結(jié)果顯示，CLP組血管壁較SHAM組增厚，CLP+NBP-L組和CLP+NBP-H組較CLP組變薄(圖3)；與CLP組相比，其他3組血管壁壁厚及WT/LR均降低(P<0.05)(表3)。表明膿毒癥導(dǎo)致大鼠腸系膜動脈的舒縮功能障礙，而NBP對膿毒癥大鼠腸系膜動脈的舒縮功能障礙有改善作用。

A.SHAM組；B.CLP組；C.CLP+NBP-L組；D.CLP+NBP-H組。

表3 腸系膜血管壁厚與WT/LR值的比較

2.4 腸系膜動脈舒張功能變化

2.4.1 ACh/SNP介導(dǎo)的SHAM組與CLP組腸系膜動脈的舒張反應(yīng) 與SHAM組相比，CLP組ACh介導(dǎo)的腸系膜動脈在加入濃度為1×10-7mol/L的ACh后，舒張功能減弱(P<0.001)，SNP介導(dǎo)的舒張功能差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明膿毒癥可能損傷了大鼠腸系膜動脈的內(nèi)皮舒張功能(圖4)。

2.4.2 ACh介導(dǎo)的CLP組和SHAM組與CLP+NBP-L組、CLP+NBP-H組的腸系膜動脈的舒張反應(yīng) 與CLP組相比，CLP+NBP-L組、CLP+NBP-H組ACh介導(dǎo)的腸系膜動脈在加入濃度為1×10-9mol/L的ACh時，舒張功能增強(P<0.001)，但舒張功能趨向于SHAM組(P>0.05)，表明NBP可以改善膿毒癥大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮舒張功能的減弱(圖5)。

***P<0.001。

***P<0.001。

2.4.3 抑制劑干預(yù)組大鼠腸系膜動脈對ACh的反應(yīng) 加入NOS抑制劑L-NAME和sGC抑制劑NS-2028后，SHAM組和CLP+NBP-L組、CLP+NBP-H組ACh介導(dǎo)的腸系膜動脈的舒張作用大部分被抑制(P<0.001)，而CLP組無明顯改變(P>0.05)。表明NBP對膿毒癥大鼠內(nèi)皮舒張功能的改善可能與NO-sGC-cGMP信號通路作用有關(guān)(圖6)。

***P<0.001。

2.5 腸系膜中eNOS、NO水平變化 CLP組大鼠腸系膜中eNOS活性和NO含量較SHAM組降低(P<0.05)，CLP+NBP-L組和CLP+NBP-H組較CLP組增高(P<0.05)。表明NBP對膿毒癥大鼠內(nèi)皮舒張功能的改善與NO-sGC-cGMP信號通路有關(guān)(表4)。

表4 腸系膜中eNOS、NO水平比較

3 討論

血管內(nèi)皮細胞具有調(diào)控血管舒縮的功能。微循環(huán)對機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和新陳代謝至關(guān)重要?；寄摱景Y時，血管內(nèi)皮細胞被病原體直接感染，脂多糖作為細菌細胞壁的主要成分可激活血管內(nèi)皮細胞表面的識別受體，使細胞釋放出大量的炎癥介質(zhì)。腸系膜動脈作為機體的阻力血管，其內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能常常受損，從而引起機體微循環(huán)功能障礙[15]，常為臨床上重癥患者病情惡化的觸發(fā)因素[2],直接或間接地影響病程的結(jié)局。

NO是在血管內(nèi)皮細胞中由NOS催化L-arginine轉(zhuǎn)化而來，再經(jīng)脂溶性擴散入平滑肌細胞，激活sGC，升高cGMP水平，減少胞內(nèi)游離的Ca2+濃度，引起血管舒張。微血管張力實驗中，用60 mmol/L的高鉀溶液預(yù)收縮血管，其機制是改變血管平滑肌細胞膜外鉀離子使其超極化，通過電壓門控鈣通道開放外鈣內(nèi)流觸發(fā)鈣庫釋放鈣離子而實現(xiàn)的；PE的縮血管機制是使血管平滑肌細胞內(nèi)的Ca2+水平升高。

NBP主要成分來自于芹菜籽[16]，研究顯示其能夠提高血管內(nèi)皮細胞的NO水平，減輕和修復(fù)神經(jīng)元的損傷[17]。本研究結(jié)果證實NBP對膿毒癥大鼠內(nèi)皮舒張功能的改善是通過增強eNOS活性使NO的水平升高。臨床上聯(lián)合尤瑞克林治療發(fā)現(xiàn)，NBP能夠抑制ET-1的生成，提高NO的分泌，從而緩解血管內(nèi)皮功能的損傷[18]。大鼠一般狀況及形態(tài)學(xué)檢測表明NBP對膿毒癥大鼠有明顯的改善，生化檢測顯示NBP能減輕膿毒癥大鼠血清中IL-6和TNF-α水平，微血管功能實驗證實NBP對膿毒癥大鼠血管損傷有保護作用，呈內(nèi)皮依賴性，分別用L-NAME和NS-2028孵育后，明顯逆轉(zhuǎn)NBP對膿毒癥大鼠血管損傷的改善作用。

總之，NBP對膿毒癥大鼠心血管和內(nèi)皮功能損傷具有保護作用，其機制可能是通過調(diào)節(jié)NO-sGC-CGMP信號通路實現(xiàn)的。