長(zhǎng)鏈非編碼RNA SOX2-OT通過(guò)靶基因miR-143-3p調(diào)控鼻咽癌增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期的分子機(jī)制

朱佳麗 曾艷 何嫻 胡文健 鐘倫坤 孫永東 王劍

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川 瀘州 646000)

鼻咽癌是臨床常見(jiàn)的一種頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率較高，鼻咽癌晚期患者出現(xiàn)惡性增生及轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后很差，目前多種癌基因或抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，但大部分生物標(biāo)志物尚不能用于綜合治療〔1，2〕。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程〔3，4〕。LncRNA SOX2-OT在前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)并可促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移〔5〕。研究表明SOX2-OT在肺鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)并可作為肺鱗狀細(xì)胞癌診斷的潛在生物標(biāo)志物〔6〕。但SOX2-OT在鼻咽癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。生物信息學(xué)分析顯示miR-143-3p可能是SOX2-OT的靶基因，miR-143-3p在卵巢癌中表達(dá)下調(diào)，并可抑制卵巢癌發(fā)生及發(fā)展〔7〕。本研究旨在探討SOX2-OT與miR-143-3p在鼻咽癌中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 永生化鼻咽上皮細(xì)胞NP69(上海信裕生物科技有限公司)，鼻咽癌細(xì)胞系6-10B、HNE-3、C666-1(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。Lipofectamine2000(美國(guó)Thermo Fisher公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，si-SOX2-OT、si-con、miR-143-3p mimics、miR-con、anti-miR-143-3p、anti-miR-con(廣州銳博生物科技有限公司)，pcDNA3.1(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(北京富龍康泰生物技術(shù)有限公司)， Transwell小室(美國(guó)Corning公司)，基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)，兔抗人細(xì)胞增殖核抗原(Ki)-67、細(xì)胞周期依賴(lài)蛋白激酶(CDK)2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9抗體(美國(guó)CST公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 NP69、HNE-3、6-10B、C666-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期HNE-3細(xì)胞(1×106個(gè)/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，分別將si-con、si-SOX2-OT、miR-con、miR-143-3p mimics、si-SOX2-OT與anti-miR-con、si-SOX2-OT與anti-miR-143-3p轉(zhuǎn)染至HNE-3細(xì)胞，分別記作si-con組、si-SOX2-OT組、miR-con組、miR-143-3p組、si-SOX2-OT+anti-miR-con組、si-SOX2-OT+anti-miR-143-3p 組。同時(shí)將未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為NC組。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中SOX2-OT、miR-143-3p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒配制qRT-PCR體系。SOX2-OT以β-actin為內(nèi)參，miR-143-3p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算SOX2-OT、miR-143-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集各組對(duì)數(shù)期HNE-3細(xì)胞(3×104個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，MTT溶液(20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μl DMSO(150 μl/孔)，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率(實(shí)驗(yàn)組/空白組×100%)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集各組對(duì)數(shù)期HNE-3細(xì)胞，常規(guī)消化后調(diào)整細(xì)胞密度為(1×106個(gè)/ml)，4℃條件下經(jīng)10 000 r/min離心5 min，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，加入500 μl預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，加入70%乙醇(3.5 ml)，充分混勻后置于4℃保存24 h，取出細(xì)胞懸液，4℃條件下經(jīng)10 000 r/min離心5 min，棄上清，向細(xì)胞沉淀加入50 μl RNaseA，37℃水浴鍋中孵育30 min，加入450 μl碘化丙啶(PI)染色液，4℃孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：上室與下室分別加入HNE-3細(xì)胞(200 μl/孔)、培養(yǎng)液(600 μl/孔)，培養(yǎng)24 h，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染液染色，觀察遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：稀釋基質(zhì)膠加入上室(40 μl/孔)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)SOX2-OT的靶基因 starbase預(yù)測(cè)顯示SOX2-OT與miR-143-3p含有結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建野生型載體WT-SOX2-OT與突變型載體MUT-SOX2-OT，分別將miR-con、miR-143-3p mimics與WT-SOX2-OT、MUT-SOX2-OT共轉(zhuǎn)染至HNE-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.7Western印跡檢測(cè)Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) 加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，滴加ECL試劑，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1SOX2-OT和miR-143-3p在鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與NP69細(xì)胞比較，鼻咽癌細(xì)胞HNE-3、6-10B、C666-1中SOX2-OT的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，其中SOX2-OT在鼻咽癌細(xì)胞HNE-3中的表達(dá)水平高于其他細(xì)胞株，因而選用HNE-3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究，與NP69細(xì)胞比較，鼻咽癌細(xì)胞系中miR-143-3p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 SOX2-OT和miR-143-3p在鼻咽癌細(xì)胞和鼻咽上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2沉默SOX2-OT抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯 與si-con組比較，si-SOX2-OT組、SOX2-OT表達(dá)、鼻咽癌細(xì)胞增殖率、S期細(xì)胞比例、Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低，G1期細(xì)胞比例顯著升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(均P<0.05)，見(jiàn)表2、圖1、圖2。

圖1 Transwell檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

1～3：NC組、si-con組、si-SOX2-OT組圖2 Western印跡檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞Ki67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

表2 沉默SOX2-OT抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

2.3SOX2-OT靶向miR-143-3p抑制其表達(dá) starbase預(yù)測(cè)顯示SOX2-OT與miR-143-3p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-143-3p過(guò)表達(dá)可顯著降低WT-SOX2-OT的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)MUT-SOX2-OT熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)表3。與si-con組(1.05±0.08)比較，si-SOX2-OT組細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)水平顯著升高(4.27±0.43，P<0.05)；與pcDNA組(0.95±0.08)比較，pcDNA-SOX2-OT組細(xì)胞中miR-143-3p表達(dá)水平顯著降低(0.46±0.05，P<0.05)。

圖3 SOX2-OT與miR-143-3p存在靶向序列

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4轉(zhuǎn)染miR-143-3p抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯 與miR-con組比較，miR-143-3p組鼻咽癌細(xì)胞增殖率、S期細(xì)胞比例、Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9表達(dá)顯著降低，miR-143-3p表達(dá)、G1期細(xì)胞比例顯著升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖4、圖5、表4。

1～3：NC組、miR-con組、miR-143-3p組圖4 Western印跡檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

圖5 Transwell檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

表4 轉(zhuǎn)染miR-143-3p抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

2.5干擾miR-143-3p部分逆轉(zhuǎn)沉默SOX2-OT抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯 與si-SOX2-OT+anti-miR-con組比較，si-SOX2-OT+anti-miR-143-3p組鼻咽癌細(xì)胞增殖率、S期細(xì)胞比例、Ki-67、CDK2、MMP-2、MMP-9蛋白水平顯著升高，miR-143-3p表達(dá)、G1期細(xì)胞比例顯著降低，遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(均P<0.05)，見(jiàn)圖6、表5、圖7。

1,2：si-SOX2-OT+anti-miR-con組、si-SOX2-OT+anti-miR-143-3p組，下圖同圖6 Transwell檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

表5 轉(zhuǎn)染anti-miR-143-3p和沉默SOX2-OT對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯的影響

圖7 Western印跡檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞中Ki-67、CDK2、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

SOX2-OT在膽管癌、試管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移〔8，9〕。本研究結(jié)果提示SOX2-OT在鼻咽癌發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮癌基因作用，沉默SOX2-OT可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。

miR-143-3p在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)量降低，LncRNA HOTAIR可通過(guò)靶向抑制miR-143-3p表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌發(fā)生及發(fā)展〔10〕。miR-143-3p可靶向抑制MYBL2表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔11〕。研究表明LncRNA LOXL1-AS1可靶向抑制miR-143-3p表達(dá)從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。研究表明miR-143-3p可靶向抑制KRAS從而抑制胰腺癌發(fā)生及發(fā)展〔13〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-143-3p在宮頸癌中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-143-3p表達(dá)可抑制宮頸癌轉(zhuǎn)移〔14〕。本研究結(jié)果提示miR-143-3p過(guò)表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期。本研究證實(shí)沉默SOX2-OT可能通過(guò)上調(diào)miR-143-3p的表達(dá)從而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。

綜上，SOX2-OT在鼻咽癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，miR-143-3p表達(dá)水平降低，沉默SOX2-OT表達(dá)可能靶向調(diào)控miR-143-3p的表達(dá)從而參與鼻咽癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，SOX2-OT可作為表觀遺傳的調(diào)控因子從而參與鼻咽癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，并可為鼻咽癌診斷及治療提供指導(dǎo)依據(jù)。但仍需進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SOX2-OT對(duì)鼻咽癌發(fā)生及發(fā)展的調(diào)控機(jī)制。