復(fù)合菌株固態(tài)發(fā)酵對(duì)大豆皮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響

李英英 丁立人 朱平華 曹新華 李 琪 李 艷 朱崇淼 杭蘇琴*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物科學(xué)類國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，南京 210095；3.南京致潤(rùn)生物科技有限公司，南京 211200)

我國(guó)是大豆消費(fèi)大國(guó)，每年加工大豆產(chǎn)生的大豆皮產(chǎn)量可達(dá)1 200萬(wàn)t。大豆皮中粗纖維含量(34%)較高，木質(zhì)素含量(<2%)較低，可消化率較高[1]，可作為潛在的畜禽飼料中的能量飼料。但由于大豆皮中高含量的粗纖維和抗?fàn)I養(yǎng)因子，如脲酶、胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等，限制了其在動(dòng)物生產(chǎn)中的利用[2]。目前提高大豆皮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的處理方法主要有物理法和化學(xué)法，其中物理法成本較高，化學(xué)法易造成酸堿的殘留。有研究表明，微生物發(fā)酵可有效降解飼料纖維并消除抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]，但目前利用微生物發(fā)酵大豆皮的研究還較少。乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌是目前常用的發(fā)酵菌種，其中，乳酸桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸，降低pH，抑制病原菌生長(zhǎng)，防止飼料霉變[4]，還能降解抗?fàn)I養(yǎng)因子，產(chǎn)生細(xì)菌素等活性物質(zhì)[5]；芽孢桿菌發(fā)酵可分泌纖維素酶等，降解纖維素和半纖維素[6]；酵母菌發(fā)酵可將纖維類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，從而提高飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7]。微生物發(fā)酵時(shí)補(bǔ)充碳源、氮源可顯著促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，提高發(fā)酵效果[8-9]。但目前關(guān)于發(fā)酵大豆皮所選取的發(fā)酵菌株種類尚沒(méi)有明確標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致大豆皮的發(fā)酵效果得不到保證。

本試驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)室保藏的乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌各4株，分別測(cè)定其生長(zhǎng)特性，篩選適宜的菌株作為候選菌株，分別用乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌單一菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮，比較單一菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵對(duì)大豆皮營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的改善效果；在此基礎(chǔ)上，于發(fā)酵基質(zhì)中補(bǔ)充碳源(麩皮)和氮源(硝酸銨、氯化銨、尿素)，進(jìn)一步分析大豆皮的營(yíng)養(yǎng)成分，評(píng)價(jià)發(fā)酵效果，為大豆皮在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料

大豆皮、麩皮、尿素均由江蘇省南通市某合作社提供，大豆皮、麩皮粉碎后過(guò)40目篩備用。

1.2 試驗(yàn)菌株

乳酸桿菌：糞腸球菌JN4(EnterococcusfaecalisJN4)、干酪乳桿菌334(Lactobacilluscasei334)、植物乳桿菌RS1(LactobacillusplantarumRS1)和植物乳桿菌LY19(LactobacillusplantarumLY19)為本實(shí)驗(yàn)室前期自行分離保存。

芽孢桿菌：枯草芽孢桿菌KC1(BacillussubtilisKC1)、納豆芽孢桿菌ND1(BacillusnattoND1)和枯草芽孢桿菌KC2(BacillussubtilisKC2)為本實(shí)驗(yàn)室前期自行分離保存，枯草芽孢桿菌6633(Bacillussubtilis6633)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

酵母菌：釀酒酵母菌SC(SaccharomycescerevisiaeSC)、產(chǎn)朊假絲酵母菌CR1(CandidautilisCR1)和釀酒酵母菌NJ(SaccharomycescerevisiaeNJ)為本實(shí)驗(yàn)室前期自行分離保存，產(chǎn)朊假絲酵母菌CR2(CandidautilisCR2)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 菌株的活化和篩選

將-20 ℃保存的乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌各4株按1%(體積比)接種量分別接種于MRS、LB和YPD培養(yǎng)基(青島海博生物有限公司)，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化，之后每3 h取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的600 nm處吸光度(OD600)值、pH、活菌數(shù)、乳酸產(chǎn)量(芽孢桿菌)、濾紙酶活性(芽孢桿菌)和菌體蛋白產(chǎn)量(酵母菌)，挑選出適宜的單一菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 單一菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮

將10 g大豆皮、20 mL水加入到160 mL發(fā)酵瓶中，混勻后1×105Pa滅菌15 min，作為大豆皮培養(yǎng)基。隨后將活化的乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌單一菌株分別以3%(體積質(zhì)量比，1×108CFU/mL)接種量接種至大豆皮培養(yǎng)基中，為單一菌株發(fā)酵組；再將乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌等比例混合后按照3%的接種量接種至大豆皮中，為復(fù)合菌株發(fā)酵組。每組發(fā)酵瓶中密封前均有正?？諝猓冗M(jìn)行有氧發(fā)酵，瓶中氧氣耗盡后進(jìn)行厭氧發(fā)酵，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后檢測(cè)產(chǎn)氣量、pH、乳酸產(chǎn)量和活菌數(shù)。

1.5 補(bǔ)充碳源和氮源發(fā)酵大豆皮

補(bǔ)充碳源(麩皮)：將10 g大豆皮、20 mL水加入160 mL發(fā)酵瓶中，試驗(yàn)分5組，試驗(yàn)組分別添加0、5%、10%和20%的麩皮，空白組為未經(jīng)任何處理的大豆皮原料，混勻后1×105Pa滅菌15 min后備用；乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌等比例混合后按照3%的接種量接種至試驗(yàn)組的大豆皮培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵48 h，通氣條件同1.4，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)發(fā)酵特性，分析大豆皮的營(yíng)養(yǎng)成分，確定麩皮的適宜添加量用于后續(xù)試驗(yàn)。

補(bǔ)充氮源(硝酸銨、氯化銨、尿素)：將10 g大豆皮、20 mL水加入160 mL發(fā)酵瓶中并添加一定量的麩皮(由上一步的結(jié)果確定)，不同氮源組分別添加1%硝酸銨、1%氯化銨和1%尿素，對(duì)照組不添加任何氮源，空白組為未經(jīng)任何處理的大豆皮原料；混勻后1×105Pa滅菌15 min后備用；乳酸桿菌、芽孢桿菌和酵母菌等比例混合后按照3%的接種量接種至不同氮源組和對(duì)照組的大豆皮培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵48 h，通氣條件同1.4，發(fā)酵結(jié)束檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)發(fā)酵特性，并分析大豆皮的營(yíng)養(yǎng)成分。

1.6 測(cè)定指標(biāo)與方法

采用乳酸試劑盒(A019-2-1，南京建成生物工程研究所)測(cè)定乳酸產(chǎn)量；采用考馬斯亮藍(lán)比色法[10]測(cè)定菌體蛋白產(chǎn)量；根據(jù)Theodorou等[11]方法測(cè)定產(chǎn)氣量并以累積產(chǎn)氣量表示；采用稀釋涂布平板法[12]檢測(cè)活菌數(shù)；采用凱氏定氮法[13]測(cè)定粗蛋白質(zhì)、真蛋白質(zhì)含量；采用濾袋法[13]測(cè)定中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量；采用滴定法測(cè)定脲酶活性；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(南京奧青生物技術(shù)有限公司，型號(hào)分別為ANG-E55247P、ANG-E55248P)測(cè)定抗原蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，通過(guò)SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey’s-b法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌株的生長(zhǎng)特性

由圖1可見(jiàn)，植物乳桿菌LY19在24 h時(shí)活菌數(shù)和乳酸產(chǎn)量均最高，顯著高于糞腸球菌JN4(P<0.05)，pH較低。由圖2可見(jiàn)，納豆芽孢桿菌ND1在24 h時(shí)活菌數(shù)、乳酸產(chǎn)量和濾紙酶活性均最高，顯著高于其他芽孢桿菌(P<0.05)，pH最低。由圖3可見(jiàn)，釀酒酵母菌NJ在24 h時(shí)活菌數(shù)顯著高于釀酒酵母菌SC和產(chǎn)朊假絲酵母CR1(P<0.05)，且菌體蛋白產(chǎn)量顯著高于其他酵母菌(P<0.05)。因此，選擇植物乳桿菌LY19、納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ用于后續(xù)大豆皮的發(fā)酵試驗(yàn)。

A：生長(zhǎng)曲線 growth curve；B：活菌數(shù) number of viable bacteria；C：pH；D：乳酸產(chǎn)量 lactic acid yield。JN4：糞腸球菌JN4 Enterococcus faecalis JN4；334：干酪乳桿菌334 Lactobacillus casei 334；RS1：植物乳桿菌RS1 Lactobacillus plantarum RS1；LY19：植物乳桿菌LY19 Lactobacillus plantarum LY19。

A：生長(zhǎng)曲線 growth curve；B：pH；C：活菌數(shù) number of viable bacteria；D：乳酸產(chǎn)量 lactic acid yield，E：濾紙酶活性 filter paper enzyme activity。6633：枯草芽孢桿菌6633 Bacillus subtilis 6633；KC1：枯草芽孢桿菌KC1 Bacillus subtilis KC1；ND1：納豆芽孢桿菌ND1 Bacillus natto ND1；KC2：枯草芽孢桿菌KC2 Bacillus subtilis KC2。

A：生長(zhǎng)曲線 growth curve；B：活菌數(shù) number of viable bacteria；C：菌體蛋白產(chǎn)量 bacterial protein yield。SC：釀酒酵母菌SC Saccharomyces cerevisiae SC；NJ：釀酒酵母菌NJ Saccharomyces cerevisiae NJ；CR2：產(chǎn)朊假絲酵母菌CR2 Candida utilis CR2；CR1：產(chǎn)朊假絲酵母菌CR1 Candida utilis CR1。

2.2 單一菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的特性

由表1可知，復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的產(chǎn)氣量顯著高于各單一菌株發(fā)酵(P<0.05)，pH顯著低于各單一菌株發(fā)酵(P<0.05)，乳酸產(chǎn)量?jī)H顯著高于單一菌株納豆芽孢桿菌ND1發(fā)酵(P<0.05)。復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的活菌數(shù)顯著高于單一菌株植物乳桿菌LY19和納豆芽孢桿菌ND1發(fā)酵(P<0.05)，但與單一菌株釀酒酵母NJ發(fā)酵無(wú)顯著差異(P>0.05)。這表明復(fù)合菌株發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌株發(fā)酵，因此選擇復(fù)合菌株發(fā)酵用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 單一菌株和復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的特性

2.3 添加麩皮對(duì)發(fā)酵大豆皮發(fā)酵特性和營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表2可知，添加麩皮能促進(jìn)菌株對(duì)大豆皮的發(fā)酵，與添加0麩皮組相比，添加5%、10%、20%麩皮組的產(chǎn)氣量及乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌活菌數(shù)均顯著提高(P<0.05)，pH顯著降低(P<0.05)。由表3可知，與空白組相比，添加10%麩皮組的粗蛋白質(zhì)含量提高了19.98%(P<0.05)，真蛋白質(zhì)含量提高了22.43%(P<0.05)，中性洗滌纖維含量降低了11.43%(P<0.05)，酸性洗滌纖維含量降低了14.17%(P<0.05)。與空白組和添加0麩皮組相比，添加10%麩皮組的脲酶活性顯著下降(P<0.05)，球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率顯著提高(P<0.05)。因此，選擇添加10%麩皮作為發(fā)酵大豆皮時(shí)的碳源用于后續(xù)試驗(yàn)。

表2 添加麩皮對(duì)發(fā)酵大豆皮發(fā)酵特性的影響

表3 添加麩皮對(duì)發(fā)酵大豆皮營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.4 添加不同氮源對(duì)發(fā)酵大豆皮發(fā)酵特性和營(yíng)養(yǎng)成分的影響

由表4可知，添加不同氮源提高了菌株的發(fā)酵特性，與對(duì)照組相比，添加硝酸銨、氯化銨和尿素組的乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌活菌數(shù)顯著提高(P<0.05)，添加氯化銨和尿素組的產(chǎn)氣量、pH、乳酸產(chǎn)量均顯著提高(P<0.05)。由表5可知，與空白組和對(duì)照組相比，添加硝酸銨、氯化銨和尿素組的粗蛋白質(zhì)含量顯著提高(P<0.05)，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量顯著降低(P<0.05)，脲酶活性顯著降低(P<0.05)，球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率顯著提高(P<0.05)；添加尿素組的真蛋白含量顯著提高(P<0.05)。因此，選擇尿素作為氮源添加到發(fā)酵大豆皮中。

表4 不同氮源對(duì)發(fā)酵大豆皮發(fā)酵特性的影響

表5 不同氮源對(duì)發(fā)酵大豆皮營(yíng)養(yǎng)成分的影響

3 討 論

3.1 發(fā)酵菌株的篩選

目前用于發(fā)酵的菌株種類繁多且生理作用不同，因此首先要進(jìn)行發(fā)酵菌株的篩選。篩選乳酸桿菌的重要指標(biāo)之一就是乳酸產(chǎn)量，因此本研究根據(jù)乳酸桿菌的乳酸產(chǎn)量等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LY19在24 h時(shí)乳酸產(chǎn)量達(dá)到107.24 mmol/L，pH最低為3.76，且活菌數(shù)最多，表明植物乳桿菌LY19具有良好的生長(zhǎng)特性，因此選擇植物乳桿菌LY19作為發(fā)酵菌株。芽孢桿菌可產(chǎn)生纖維素酶降解纖維，本試驗(yàn)根據(jù)濾紙酶活性等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)納豆芽孢桿菌ND1產(chǎn)生的濾紙酶活性達(dá)24.51 FPU/mL。國(guó)立東等[14]從發(fā)酵豆豉中分離到的芽孢桿菌產(chǎn)纖維素酶活性為21.14 U/mL，與本研究結(jié)果相似，因此選擇納豆芽孢桿菌ND1作為發(fā)酵菌株。酵母菌可以通過(guò)自身繁殖產(chǎn)生菌體蛋白[15]，本研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母菌NJ的菌體蛋白產(chǎn)量高于其他酵母菌，且釀酒酵母菌NJ的活菌數(shù)及OD600值較高，因此選擇釀酒酵母菌NJ作為發(fā)酵菌株。

3.2 復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的效果

單菌株作用單一，使用單一菌株發(fā)酵大豆皮效果往往難以達(dá)到理想狀態(tài)。Refstie等[16]研究表明，單獨(dú)用乳酸桿菌發(fā)酵豆粕對(duì)植酸的降解作用不明顯，而有研究表明復(fù)合菌株之間可能存在共生協(xié)同關(guān)系，能幫助微生物更好地適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境系統(tǒng)[17]。本研究中，復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的產(chǎn)氣量、pH、活菌數(shù)等均優(yōu)于植物乳桿菌、納豆芽孢桿菌和釀酒酵母菌單獨(dú)發(fā)酵，其原因可能與3株菌株之間存在共生協(xié)同關(guān)系，有助于微生物適應(yīng)環(huán)境有關(guān)[18]。植物乳桿菌LY19發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，可降低大豆皮的pH而抑制病原微生物生長(zhǎng)；納豆芽孢桿菌ND1能夠降低大豆皮中的脲酶，并產(chǎn)生維素酶降解大豆皮中的纖維生成單糖；而釀酒酵母菌NJ則可以利用芽孢桿菌產(chǎn)生的單糖進(jìn)行生長(zhǎng)，產(chǎn)生菌體蛋白，提高大豆皮中蛋白質(zhì)含量。此外，納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母菌NJ發(fā)酵消耗大量氧氣，進(jìn)而為植物乳桿菌LY19生長(zhǎng)提供厭氧環(huán)境?；诖?，3株菌株在大豆皮發(fā)酵過(guò)程中共同作用從而提高了發(fā)酵效果。Zhang等[19]用乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌復(fù)合發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)可以去除豆粕中的蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而提高豆粕的飼用價(jià)值。胡永娜等[20]采用枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母和糞腸球菌混合發(fā)酵菜籽粕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽粕中的異硫氰酸酯和唑烷硫酮等抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解率高達(dá)80%以上。這與本研究復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮效果優(yōu)于單一菌株的結(jié)果一致，表明復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮效果優(yōu)于單一菌株發(fā)酵大豆皮。

3.3 大豆皮發(fā)酵效果的優(yōu)化

前期研究表明，復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的效果優(yōu)于單一菌株發(fā)酵，為了進(jìn)一步提高復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的效果，更好地改善大豆皮的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可通過(guò)添加碳源如麩皮來(lái)促進(jìn)菌株的生長(zhǎng)。麩皮中約含有20%可溶性纖維，可被微生物利用促進(jìn)增殖。童鑫等[21]用釀酒酵母和嗜酸乳桿菌發(fā)酵棗渣時(shí)加入碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，顯著提高了棗渣的蛋白質(zhì)含量。本研究中，添加10%麩皮促進(jìn)了菌株在大豆皮中的生長(zhǎng)和發(fā)酵，大豆皮的粗蛋白質(zhì)含量提高了19.98%，真蛋白質(zhì)含量提高了22.43%，中性洗滌纖維含量降低了11.43%，酸性洗滌纖維含量降低了14.17%；同時(shí)，抗?fàn)I養(yǎng)因子脲酶活性降至0.15 U/g，抗原蛋白降解率提高，可見(jiàn)添加麩皮后大豆皮品質(zhì)有一定的提高，這與張開(kāi)磊等[22]的研究結(jié)果一致。此外，氮源也是微生物生長(zhǎng)發(fā)酵所必需的物質(zhì)，因此在添加麩皮的基礎(chǔ)上又添加了不同種類的氮源來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)發(fā)酵效果。本研究中，添加不同種類的氮源(硝酸銨、氯化銨和尿素)提高了菌株的發(fā)酵特性，并且大豆皮的粗蛋白質(zhì)、真蛋白質(zhì)含量提高，中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量降低，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量也降低。這表明添加不同種類的氮源促進(jìn)了復(fù)合菌株的生長(zhǎng)，從而提高了發(fā)酵效果，蛋白質(zhì)含量的增加可能是酵母菌菌體利用額外添加氮源合成自身蛋白質(zhì)的絕對(duì)增長(zhǎng)[23]。陳廣銀等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在厭氧發(fā)酵麥稈過(guò)程中添加不同氮源(尿素、氯化銨、硝酸鉀)提高了微生物活性，主要體現(xiàn)在厭氧微生物的產(chǎn)氣能力和產(chǎn)氣速率提高，促進(jìn)了微生物對(duì)麥稈纖維素和半纖維素的降解，且添加尿素的效果最好，這與本研究結(jié)果一致。本研究中，添加1%尿素作為發(fā)酵大豆皮的氮源時(shí)，粗蛋白質(zhì)含量提高了34.09%，中性洗滌纖維含量降低了16.38%，酸性洗滌纖維含量降低了16.11%，球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率分別提高了23.29%和24.20%，脲酶活性降低至0.01 U/g。因此，選擇添加1%尿素作為發(fā)酵大豆皮的氮源效果較好。

4 結(jié) 論

植物乳桿菌LY19、納豆芽孢桿菌ND1和釀酒酵母NJ復(fù)合菌株具有發(fā)酵大豆皮的潛力；通過(guò)單因素試驗(yàn)，優(yōu)化了復(fù)合菌株發(fā)酵大豆皮的條件，即添加10%麩皮和1%尿素，在料水比1∶2、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，復(fù)合菌株能降低大豆皮中纖維(中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維)含量，降低脲酶活性，提高球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解率，改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。