乙氧喹對脂多糖和D-氨基半乳糖誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

李佩璇 吳志凱 孫有朋 符貽武 王 霞 王晶晶 周二順 楊正濤

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225)

乙氧喹(ethoxyquin)是一種具有抗氧化活性的化合物，在飼料加工中常被用來保護(hù)脂質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分免受氧化降解[1]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。研究表明，蛋雞飼糧中添加乙氧喹，不僅能有效防止飼料中營養(yǎng)成分氧化，還能提高血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，降低血清丙二醛(MDA)含量，從而改善肝臟功能[2]；飼糧中添加乙氧喹可以減緩犢牛斷奶引起的氧化應(yīng)激，促進(jìn)犢牛瘤胃發(fā)育[3]；但在犬、貓飼糧中，盡管毒理學(xué)研究表明乙氧喹無致癌性和遺傳毒性，但其代謝物可能與犬、貓生殖障礙、自身免疫性疾病和癌癥相關(guān)[4]。飼糧中的乙氧喹在胃腸道被吸收后首先進(jìn)入肝臟，必然對肝臟代謝產(chǎn)生影響。在現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖行業(yè)所采用的大規(guī)模集約化養(yǎng)殖方式，主要是為了在最短的時(shí)間和最低的成本下獲取最大的經(jīng)濟(jì)收益，所配制的飼糧往往使畜禽肝臟代謝負(fù)荷加重，而維護(hù)肝臟機(jī)能也成為維護(hù)群體健康水平重要的抓手[5]。關(guān)于乙氧喹在畜禽飼料加工中的應(yīng)用還存在著一些爭議，目前歐盟已經(jīng)禁止在飼料中使用乙氧喹，但國內(nèi)仍然充許應(yīng)用，有關(guān)乙氧喹在體內(nèi)對動(dòng)物機(jī)體的影響，尤其對肝臟功能的影響，有必要進(jìn)一步深入研究。脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導(dǎo)的急性肝損傷(acute liver injury，ALI)模型，是研究各種抗氧化劑的理想工具[6-7]。LPS可引起肝臟氧化應(yīng)激，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的大量釋放，D-GalN則可增加肝細(xì)胞對LPS的敏感性，腹腔注射LPS和D-GalN可誘導(dǎo)建立典型的ALI模型，在該模型中氧化應(yīng)激起關(guān)鍵作用[8]。因此，本試驗(yàn)通過腹腔注射LPS和D-GalN建立小鼠ALI模型，并在該模型上探究乙氧喹對肝臟炎性反應(yīng)以及氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，從而為乙氧喹的運(yùn)用和相關(guān)政策制定提供部分試驗(yàn)依據(jù)。

圖1 乙氧喹化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

6周齡體重24～28 g雄性昆明小鼠40只，購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：NO.SCXK(粵)2018-0002。所有小鼠均置于溫度(25±1) ℃、相對濕度45%～55%條件下飼養(yǎng)，明暗循環(huán)12 h，自由飲水和采食。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

將40只小鼠隨機(jī)分為以下5組：空白組、模型組以及乙氧喹低(50 μg/kg)、中(100、μg/kg)、高劑量(200 μg/kg)組，每組8只。取200 mg的乙氧喹溶解于500 μL的二甲基亞砜(DMSO)，再加入500 μL的吐溫80，最后加入生理鹽水定容為10 mL、20 mg/mL的母液，根據(jù)每組小鼠體重計(jì)算所需濃度，將母液稀釋為工作液?？瞻捉M和模型組溶劑(生理鹽水+5% DMSO+5%吐溫80)做上述相同處理。乙氧喹各劑量組每天腹腔注射1次，連續(xù)注射3 d，空白組和模型組注射同體積溶劑。第3天注射乙氧喹1 h后，空白組小鼠腹腔注射同體積生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射500 μg/kg的LPS和500 mg/kg的D-GalN。

1.2 試劑與儀器

LPS(大腸桿菌055∶B5)、D-GalN購自美國Sigma公司；乙氧喹購自上海阿拉丁生化科技有限公司；DMSO購自上海麥克林生化科技有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，貨號：C009-2-1)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST，貨號：C010-2-1)、MDA(貨號：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD，貨號：A001-1-2)、髓過氧化物酶(MPO，貨號：A044-1-1)和GSH-Px(貨號：A005-1-2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；TRIzol購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；RevertAidTM第1鏈cDNA合成試劑盒(貨號：K1621)、BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(貨號：23225)購自賽默飛世爾科技公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；兔源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)多克隆抗體(貨號：YT0099)購自美國Immunoway公司；兔源核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)多克隆抗體(貨號：BM3932)購自美國博士德生物工程有限公司；兔源核因子-κB(NF-κB)p65多克隆抗體(貨號：8242s)、兔源磷酸化p65(p-p65)多克隆抗體(貨號：3033s)、兔源磷酸化核因子-κB抑制蛋白α(p-IκBα)多克隆抗體(貨號：2859)、兔源血紅素氧合酶-1(HO-1)多克隆抗體(貨號：43966s)、兔源核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)多克隆抗體(貨號：12721s)均購自美國Cell Signing Technology公司；山羊抗兔免疫球蛋白二抗(貨號：SA00001-2)購自美國Proteintech公司。其余所有化學(xué)品均為試劑級。

主要儀器包括熒光顯微鏡(RVL-100，美國Discover ECHO公司)、酶標(biāo)儀(iMark，美國Bio Rad公司)、紫外分光光度計(jì)(T6，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop One，美國賽默飛世爾科技公司)、PCR儀(1855200，美國Bio Rad公司)、多功能凝膠成像系統(tǒng)(c280，美國Azure Biosystems公司)。

1.3 組織病理學(xué)分析

LPS和D-GalN注射后4 h收集肝臟組織，并在10%福爾馬林溶液中固定。切片經(jīng)分級乙醇脫水后石蠟包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察組織病理變化。

1.4 血清ALT、AST活性檢測

在LPS和D-GalN刺激后4 h采集血液，4 ℃下放置過夜，離心分離血清。根據(jù)試劑盒的說明檢測，510 nm波長下酶標(biāo)儀讀取吸光度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清ALT和AST活性。

1.5 肝臟MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性檢測

小鼠肝臟組織與生理鹽水(1∶9)勻漿，離心收集上清，按照相應(yīng)的試劑盒說明書檢測肝臟MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測肝臟IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相對表達(dá)水平

液氮研磨肝臟組織，使用TRIzol提取總RNA，并溶解在0.1%焦碳酸二乙酯溶液中。使用微量紫外分光光度計(jì)檢測提取的RNA濃度和純度?？俁NA儲(chǔ)存在-80 ℃直至用于cDNA合成。根據(jù)說明書，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RT-qPCR使用CFX connect熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進(jìn)行，引物見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為參比基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

肝臟組織裂解樣本低溫離心10 min，取上清用BCA試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度，同時(shí)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶中封閉4 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗滌后二抗孵育1 h，Tris緩沖鹽水洗滌3次，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL plus)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)圖像分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。使用GraphPad Prims 9.0通過單因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett-t檢驗(yàn)法分析不同組之間差異的顯著性。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙氧喹對ALI小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響

如圖2所示，空白組肝臟結(jié)構(gòu)形態(tài)正常(圖2-A)。模型組肝臟組織出現(xiàn)明顯異常變化，如肝臟組織明顯腫脹，排列紊亂，肝細(xì)胞間隙可見炎細(xì)胞浸潤并出血(圖2-B)。乙氧喹低、中、高劑量組小鼠病理變化介于空白組與模型組之間，且隨著劑量增大改善效果越明顯，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系(圖2-C、圖2-D、圖2-E)。

A：空白組 blank group；B：模型組 model group；C、D、E：乙氧喹低、中、高劑量組 ethoxyquin low, medium and high dose groups。

2.2 乙氧喹對ALI小鼠血清ALT、AST活性的影響

如圖3所示，與空白組相比，模型組的血清ALT和AST活性顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，乙氧喹低、中、高劑量組的血清ALT和AST活性顯著降低(P<0.05)。這說明乙氧喹預(yù)處理有效緩解了LPS和D-GalN引起的肝功能損傷。

Control：空白組；LPS/D-GalN：模型組；Ethoxyquin：乙氧喹劑量組。*表示差異顯著(P<0.05)，ns表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

2.3 乙氧喹對ALI小鼠肝臟MDA含量及MPO、SOD、GSH-Px活性的影響

如圖4所示，與空白組相比，模型組的肝臟MPO活性和MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，乙氧喹低、中、高劑量組的肝臟MPO活性和MDA含量顯著降低(P<0.05)，GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；乙氧喹低劑量組的肝臟SOD活性無顯著差異(P>0.05)，乙氧喹中、高劑量組的肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05)。這說明乙氧喹預(yù)處理有效減輕了LPS和D-GalN引起的炎癥和氧化應(yīng)激。

圖4 乙氧喹對ALI小鼠肝臟MDA含量及MPO、SOD、GSH-Px活性的影響

2.4 乙氧喹對ALI小鼠肝臟促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，與空白組相比，模型組的肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，乙氧喹低、中、高劑量組的肝臟TNF-α和IL-6的mRNA相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)；乙氧喹低劑量組的肝臟IL-1β的mRNA相對表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，乙氧喹中、高劑量組的肝臟IL-1β的mRNA相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。這說明乙氧喹預(yù)處理抑制了LPS和D-GalN引起的炎性細(xì)胞因子的釋放。

圖5 乙氧喹對ALI小鼠肝臟TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)的影響

2.5 乙氧喹對ALI小鼠肝臟NF-κB、Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與空白組相比，模型組的肝臟p65和IκBα的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，乙氧喹低、中、高劑量組的肝臟p65的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)，乙氧喹低、高劑量組的肝臟IκBα的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。這說明乙氧喹抑制了NF-κB信號通路的活化。

圖6 乙氧喹對ALI小鼠肝臟NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與空白組相比，模型組的肝臟Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。與模型組相比，乙氧喹低、中、高劑量組的肝臟Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。這說明乙氧喹激活了Nrf2信號通路。

圖7 乙氧喹對ALI小鼠肝臟Nrf2信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

乙氧喹成本低廉，抗氧化能力強(qiáng)，已有資料證實(shí)飼糧中添加乙氧喹不但可以保護(hù)脂質(zhì)成分免受氧化破壞，在體內(nèi)還可以提高雛雞和黃魚的生長性能，促進(jìn)犢牛瘤胃發(fā)育，對黃曲霉毒素所致的大鼠肝損傷也具有一定保護(hù)作用[3, 9-11]。但是，有關(guān)乙氧喹生物活性的基礎(chǔ)研究還不夠詳盡，對乙氧喹在飼糧中的使用還存在著爭議，歐盟已禁止在飼糧中添加乙氧喹，國內(nèi)一般添加的劑量是每千克飼糧中不超過150 mg。實(shí)際上，因動(dòng)物品種、年齡和飼糧組成等影響，飼糧中乙氧喹的適宜添加量也不同，過高劑量的乙氧喹會(huì)造成動(dòng)物肝臟、腎臟及胃腸道損傷，但適宜劑量時(shí)又能保護(hù)肝臟功能[4]。

根據(jù)報(bào)道，LPS和D-GalN誘導(dǎo)的小鼠ALI被廣泛用于研究肝損傷[12]。血清ALT和AST活性是評估肝功能的常用指標(biāo)[13]。當(dāng)肝臟受損時(shí)，血液中ALT和AST活性顯著升高。本試驗(yàn)結(jié)果表明，乙氧喹降低了LPS和D-GalN誘導(dǎo)的小鼠血清AST和ALT活性。此外，組織病理學(xué)觀察還闡明乙氧喹對LPS和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。

MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，常被用于評估不同組織的氧化應(yīng)激[14]。MPO被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞浸潤的生物標(biāo)志物，其活性增加代表中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥增加。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化指標(biāo)，可清除自由基保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[15]。檢測小鼠肝臟MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性，可以闡明乙氧喹對LPS和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)機(jī)制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，乙氧喹可能通過提高小鼠抗氧化能力來保護(hù)LPS和D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷。

研究表明，炎癥細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生與肝損傷的發(fā)展密切相關(guān)[16]。其中，TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)許多細(xì)胞反應(yīng)，包括肝細(xì)胞凋亡和壞死[17]。IL-1β是白細(xì)胞介素-1(IL-1)的一個(gè)亞型，可刺激多種次級細(xì)胞因子的產(chǎn)生并放大炎癥反應(yīng)[18]。IL-6作為兼具抗炎和促炎作用的細(xì)胞因子，與細(xì)胞損傷密切相關(guān)[19]。本試驗(yàn)檢測了肝臟TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相對表達(dá)水平，結(jié)果表明乙氧喹對LPS和D-GalN誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6的相對表達(dá)有明顯的抑制作用，說明乙氧喹可以減少LPS和D-GalN誘導(dǎo)的炎癥。因此，本研究進(jìn)一步探討了乙氧喹的確切抗炎機(jī)制。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，有研究報(bào)道，NF-κB信號通路被激活后，其下游促炎因子的表達(dá)增加[20]。在正常生理?xiàng)l件下，NF-κB被其抑制蛋白(IκBα)以非活性形式隔離在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)NF-κB被激活時(shí)，它在細(xì)胞質(zhì)中與IκBα分離并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的異常轉(zhuǎn)錄[21]。通過Western Blot檢測p-IκBα、IκBα、p-p65和p65的相對蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)乙氧喹抑制了LPS和D-GalN誘導(dǎo)p65磷酸化，隨后阻斷了IκBα磷酸化和降解，這可能是乙氧喹的抗炎機(jī)制之一。

研究表明，炎癥和氧化應(yīng)激是相互關(guān)聯(lián)的[6]。在正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體通過抗氧化防御機(jī)制實(shí)現(xiàn)氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。Nrf2是抗氧化防御系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄，如SOD、GSH-Px等[22-23]。通常，Nrf2主要通過與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Keap1)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架相互作用而位于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)受到刺激時(shí)，Nrf2與Keap1分離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，調(diào)節(jié)HO-1的轉(zhuǎn)錄[24]。作為Nrf2的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)之一，HO-1以其重要的抗氧化能力成為抗氧化防御的重要因素[25]。乙氧喹有效增加了肝臟Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)，表明乙氧喹可以激活Nrf2信號通路，這可能是乙氧喹在LPS和D-GalN誘導(dǎo)的ALI小鼠中發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制之一。

4 結(jié) 論

綜上所述，本試驗(yàn)通過腹腔注射乙氧喹，在設(shè)置的水平可以發(fā)揮乙氧喹體內(nèi)抗氧化作用，通過抑制NF-κB信號和激活Nrf2信號來保護(hù)LPS和D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷，且在本試驗(yàn)條件下設(shè)置的3個(gè)劑量中，200 μg/kg為適宜劑量。這說明乙氧喹不僅是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的飼料添加劑，還可能作為一種肝損傷保護(hù)劑應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖行業(yè)中。