鴨油甘油二酯對肥胖大鼠減肥降脂作用與機制研究

孫 宇 王寶維,2* 張名愛,2 楊 洵 尹佩佩 凡文磊,2 孔 敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266109；2.國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系營養(yǎng)與飼料功能研究室，青島 266109；3.山東省食品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，青島 266109；4.青島市食品質(zhì)量安全風(fēng)險評估工程研究中心,青島 266109)

油脂可以為人類提供能量、必需脂肪酸和脂溶性維生素，是人類食物的基本成分，是一種重要的營養(yǎng)素[1]。近幾年來，我國患肥胖及相關(guān)代謝性疾病的人數(shù)迅速上升，其中油脂的攝入過量是造成這類現(xiàn)象的重要因素之一。與此同時，寵物犬、貓肥胖也已經(jīng)成為全球日益嚴重的問題，影響寵物的生長和繁殖，引發(fā)疾病，減少寵物的壽命，然而許多寵物主人沒有意識到他們的寵物超重和健康風(fēng)險。在我們?nèi)粘ｏ嬍持兴玫挠椭院?2個以上碳原子的長鏈脂肪酸(LCFAs)構(gòu)成的長鏈不飽和甘油三酯(LCTs)為主[2]，攝入過多會增加血液中甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量，最終導(dǎo)致心腦血管疾病、肥胖癥、脂肪肝、癌癥等慢性病的發(fā)生[3]。

甘油二酯結(jié)構(gòu)與TG相似，但代謝和消化途徑不同，甘油二酯是油脂的天然成分，也是油脂在體內(nèi)代謝的中間產(chǎn)物。甘油二酯具有安全營養(yǎng)、加工適應(yīng)性好、人體相容性高等優(yōu)點，是以食用油為原料制備的一類多功能添加劑，有關(guān)研究表明其具有良好的降低血脂、減輕體重、減少體脂等作用，而且食用安全，因而受到廣泛關(guān)注[4]。甘油二酯代替食用油不僅符合人們對低熱量健康食品的要求，而且不影響食用口感，還能夠有效抑制體重增加。周君[5]證明了甘油二酯具有減少內(nèi)臟脂肪、降低血脂以及控制體重增加等功能。Takatoshi等[6]發(fā)現(xiàn)甘油二酯能夠減少小鼠體內(nèi)脂肪積聚，從而起到控制體重增長的作用。Tomonobu等[7]發(fā)現(xiàn)甘油二酯有改善餐后血脂的功效。Soni等[8]、Ijiri等[9]及Chengelis等[10]對甘油二酯的毒性及致癌性的研究發(fā)現(xiàn)，甘油二酯對人體是安全的，不增加人體患癌風(fēng)險。

脂質(zhì)是機體內(nèi)進行各種穩(wěn)態(tài)、生理和細胞過程所必需的重要成分[11]。人體許多重大健康問題都是脂質(zhì)代謝失調(diào)導(dǎo)致的，如肥胖和非酒精性脂肪肝。脂質(zhì)組學(xué)是一種新型的組學(xué)策略，可以在分子水平上測定脂質(zhì)組成和鑒定脂質(zhì)生物標志物來研究脂質(zhì)代謝。通過對各種脂質(zhì)進行全面、系統(tǒng)的定量分析，來確定脂類作為信號分子的作用及其對代謝途徑的調(diào)控，闡明物質(zhì)與代謝之間的相互作用[12]。

本研究利用鴨油、鴨油甘油二酯對肥胖大鼠進行灌胃處理，通過對大鼠的體重、體脂、血清生化指標、脂質(zhì)代謝組學(xué)等指標測定分析，研究鴨油甘油二酯對肥胖模型大鼠體重、脂肪沉積量和脂質(zhì)代謝指標的影響，探索鴨油甘油二酯對大鼠機體脂肪沉積規(guī)律和代謝機理，為進一步探明鴨油甘油二酯降脂功能提供科學(xué)依據(jù)，為鴨油產(chǎn)品的深度開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

鴨油(從超市購買)，鴨油甘油二酯(按照專利號ZL201610061434.1方法進行制備，純度達到86%)。TC、TG、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。主要儀器包括高速離心機、電子分析天平、皮尺、注射器、分光光度計、離心濃縮儀、渦旋混合器、超聲清洗儀等。

1.2 試驗設(shè)計與方法

試驗選擇80只體重相近的4周齡雄性SD大鼠，經(jīng)過7 d適應(yīng)期飼養(yǎng)后，進行2個階段試驗。造模階段：將80只大鼠隨機分為2個組，對照組每組4個重復(fù)，每個重復(fù)5只；造模組每組12個重復(fù)，每個重復(fù)5只。對照組大鼠自由采食基礎(chǔ)飼糧，造模組大鼠自由采食脂肪含量為60%的高脂飼糧，連續(xù)飼養(yǎng)28 d。修復(fù)干預(yù)階段：將造模組中60只肥胖大鼠隨機分為3組(模型對照組、鴨油組、鴨油甘油二酯組)，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)5只。模型對照組以2 mL蒸餾水灌胃，每天灌胃1次，用高脂飼糧連續(xù)喂養(yǎng)30 d；鴨油組和鴨油甘油二酯組分別用2 mL鴨油和2 mL鴨油甘油二酯進行灌胃，每天灌胃1次，用基礎(chǔ)飼糧連續(xù)喂養(yǎng)30 d；對照組以2 mL蒸餾水灌胃，每天灌胃1次，用基礎(chǔ)飼糧連續(xù)喂養(yǎng)30 d。試驗設(shè)計見表1。

表1 試驗設(shè)計

試驗飼糧均購于北京某飼料有限公司，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧和高脂飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗期間，大鼠自由采食、飲水(去離子水)，室內(nèi)溫度(22±2) ℃，相對濕度(55±5)%，室內(nèi)通風(fēng)良好。每天觀察大鼠的精神狀態(tài)，記錄采食量和飲水量，并且每周稱量1次體重。

1.4 樣品采集和指標測定

試驗結(jié)束后，對大鼠禁食24 h后，測量體重、體長，計算Lee’s指數(shù)，對每組的大鼠進行取樣分析。采取眼球取血，3 000 r/min離心10 min，取血清-80 ℃保存。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟，檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C含量。脊椎脫臼法處死大鼠后，分離肝臟、心臟、脾臟、腎臟、睪丸等器官，置于冷生理鹽水中洗凈后用濾紙吸干其表面液體進行稱重，計算肝體比、心體比、脾體比、腎體比、睪體比。相關(guān)計算公式如下：

Lee’s指數(shù)=(體重×103)1/3/體長[13]；肝體比=(肝臟重/體重)×100；心體比=(心臟重/體重)×100；脾體比=(脾臟重/體重)×100；腎體比=(腎臟重/體重)×100；睪體比=(睪丸重/體重)×100。

將稱量后的肝臟取肝尖部位存放于凍存管中，用液氮速凍，-80 ℃保存。肝臟脂質(zhì)代謝組學(xué)測定：從肝臟中提取總脂，參考Feng等[12]的方法。數(shù)據(jù)采集儀器系統(tǒng)主要包括超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)和串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)，分析條件和詳細的工作參數(shù)參考Feng等[12]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.6和SPSS 17.0軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進行差異顯著性分析，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠體重和體脂的影響

從圖1可以看出，各組之間大鼠初始體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。造模完成時，與對照組相比，其他各組的體重顯著升高(P<0.05)，表明造模成功。試驗結(jié)束時，與模型對照組相比，鴨油組最終體重顯著降低(P<0.05)，鴨油甘油二酯組最終體重極顯著降低(P<0.01)；與鴨油組相比，鴨油甘油二酯組最終體重顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，鴨油組腹脂率顯著降低(P<0.05)，鴨油甘油二酯組腹脂率極顯著降低(P<0.01)；與鴨油組相比，鴨油甘油二酯組腹脂率顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，鴨油甘油二酯可以控制大鼠體重增長，降低體脂率。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

2.2 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠Lee’s指數(shù)的影響

從圖2可以看出，與模型對照組相比，鴨油組Lee’s指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，鴨油甘油二酯組Lee’s指數(shù)顯著降低(P<0.05)；與鴨油組相比，鴨油甘油二酯組Lee’s指數(shù)顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明，鴨油甘油二酯對Lee’s指數(shù)有影響，可以控制體型發(fā)育。

圖2 肥胖大鼠Lee’s指數(shù)

2.3 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠臟體比的影響

從圖3可以看出，與模型對照組相比，鴨油組肝體比無顯著差異(P>0.05)，鴨油甘油二酯組肝體比顯著升高(P<0.05)。從表3可以看出，與模型對照組相比，鴨油組和鴨油甘油二酯組心體比、脾體比、腎體比、睪體比無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明，鴨油甘油二酯對心臟、脾臟、腎臟、睪丸等器官生長發(fā)育不會產(chǎn)生影響，安全性好；鴨油甘油二酯避免了肝臟的肥大。

表3 肥胖大鼠臟體比

圖3 肥胖大鼠肝體比

2.4 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠血清生化指標的影響

從圖4可以看出，模型對照組的大鼠出現(xiàn)血脂異常，其血清TG、TC、LDL-C含量較對照組顯著升高(P<0.05)，血清HDL-C含量有所降低(P>0.05)。與模型對照組相比，鴨油甘油二酯組血清TG、TC含量極顯著降低(P<0.01)，血清LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血清HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)。與鴨油組相比，鴨油甘油二酯組血清TG、TC、LDL-C含量顯著降低(P<0.05)，血清HDL-C含量差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明，鴨油甘油二酯能夠降低大鼠血清TC、TG、LDL含量，提高血清HDL-C含量，降低血脂水平，從而維護脂類代謝正常進行。

圖4 肥胖大鼠的血清生化指標

2.5 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

為了進一步研究鴨油甘油二酯對肥胖大鼠脂質(zhì)代謝的影響，本試驗基于脂質(zhì)組學(xué)方法分析了脂質(zhì)組成的差異。從圖5-A和圖5-B可以看出，對照組和模型對照組之間分離，而模型對照組和鴨油甘油二酯組分離，這表明鴨油甘油二酯的補充改善了脂質(zhì)代謝的紊亂。為了尋找差異代謝物，采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)提取自變量(X)和因變量(Y)中的成分，然后計算各成分之間的相關(guān)性，獲得了多元OPLS-DA模型，其驗證參數(shù)分別為對照組和模型對照組的適合度(R2X=0.726和R2Y=1.000)和可預(yù)測性(Q2=0.960)、模型對照組和鴨油甘油二酯組的適合度(R2X=0.643和R2Y=0.996)和可預(yù)測性(Q2=0.792)。結(jié)果表明，OPLS-DA模型具有良好的擬合度，可作為一種預(yù)測模型，用于全面評估脂質(zhì)組學(xué)特征的變化。在對照組和模型對照組以及模型對照組和鴨油甘油二酯組(圖5-C和圖5-D)中觀察到OPLS-DA評分圖的清晰分離，以上結(jié)果表明模型對照組的脂質(zhì)代謝紊亂，但可通過鴨油甘油二酯的添加減弱脂質(zhì)代謝紊亂。

如火山分析圖所示(圖5-E和圖5-F)，篩選出不同的脂質(zhì)生物標記候選物。使用差異倍數(shù)(FC)≥2或≤0.5和變量重要性投影(VIP)≥1的標準，模型對照組與對照組相比，2組之間檢測出320種差異代謝物，其中上調(diào)了79種代謝產(chǎn)物，下調(diào)了241種代謝產(chǎn)物。模型對照組與鴨油甘油二酯組相比，2組之間檢測出169種差異代謝物，其中上調(diào)了26種代謝產(chǎn)物，下調(diào)了143種代謝產(chǎn)物。其中，顯著(P<0.05)下調(diào)的脂類主要集中在甘油脂類。

DZ：對照組 control group；MX：模型對照組 model control group；DG：鴨油甘油二酯組 duck oil diglyceride group。下圖同 the same as below。

為了進一步研究脂質(zhì)生物標志物是否與鴨油甘油二酯的生物活性相關(guān)，對脂質(zhì)組成的差異進行分析。在肝臟組織中共鑒定出895種脂類代謝物，其中包括249種TG，70種甘油二酯，24種游離脂肪酸(FFA)，28種神經(jīng)酰胺(CER)，21種膽固醇酯(CE)，106種磷脂酰膽堿(PC)，114種磷脂酰乙醇胺(PE)和其他物質(zhì)。從圖6-A可以看出，模型對照組的肝臟TG、甘油二酯、FFA、CE、?；鈮A(CAR)、油菜素甾醇脂(CASE)含量顯著升高(P<0.05)，表明大鼠的脂質(zhì)代謝嚴重紊亂。從圖6-B可以看出，甘油二酯組的肝臟TG、PC、CE、甘油二酯、CAR、溶血磷脂酰膽堿(LPC)和FFA含量顯著降低(P<0.05)。由此可見，高脂飼糧引起的脂質(zhì)代謝紊亂在鴨油甘油二酯治療后得到部分改善。

對模型對照組與對照組以及模型對照組與鴨油甘油二酯組進行差異脂質(zhì)分析。與對照組相比，模型對照組241種脂質(zhì)異常增加，其中包括183種TG，17種甘油二酯、CE，5種PC，4種FFA，3種LPC，2種PE、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、CASE，1種磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、單甘油酯(MG)、糖鞘脂(HexCer)、CAR、半單磷酸甘油酯(BMP)。與模型對照組相比，鴨油甘油二酯組部分脂質(zhì)顯著降低(P<0.05)。

通過對路徑分析可以為不同脂類可能參與的生化和信號傳導(dǎo)途徑提供一些線索。從圖6-C和圖6-D可以看出，與對照組相比，模型對照組的大鼠明顯被破壞了脂肪細胞的甘油酯代謝、固醇代謝、脂肪消化吸收、生熱和脂肪分解調(diào)節(jié)途徑。而甘油二酯改善了脂肪細胞的甘油酯代謝、產(chǎn)熱作用和脂肪分解調(diào)節(jié)途徑、磷脂酶D的信號通路、膽固醇代謝。以上結(jié)果表明，鴨油甘油二酯可以修復(fù)相關(guān)代謝途徑。

GL：甘油脂類 glycerolipids；GP：甘油磷脂類 glycerophospholipids；ST：甾醇脂類 sterol lipids；FA：脂肪酰類 fatty acyl；SL：鞘脂類 sphingolipids；Vitamin digestion and absorption：維生素的消化和吸收；Thermogenesis：生熱作用；Steroid biosynthesis：類固醇生物合成；Spinocerebellar ataxia：脊髓小腦的共濟失調(diào)；Salivary secretion：唾液分泌；Regulation of lipolysis in adipocytes：脂肪細胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)；Ovarian steroidogenesis：卵巢類固醇生成；NF-kappa B signaling pathway：核因子-κB信號通路；Metabolic pathways：代謝途徑；Insulin resistance：胰島素抵抗；Inositol phosphate metabolism：磷酸肌醇代謝；HIF-1 signaling pathway：HIF-1信號通路；Growth hormone synthesis, secretion and action：生長激素的合成、分泌和作用；Glycerolipid metabolism：甘油酯類代謝；Glutamatergic synapse：谷氨酸能系統(tǒng)；Gastric acid secretion：胃酸分泌；Fat digestion and absorption：脂肪消化吸收；Ether lipid metabolism：醚脂質(zhì)代謝；Cholesterol metabolism：膽固醇代謝；Bile secretion：膽汁分泌；Regulation of actin cytoskeleton：肌動蛋白細胞骨架的調(diào)節(jié)；Phospholipase D signaling pathway：磷脂酶D信號通路；Phosphatidylinositol signaling system：磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)；Pathways in cancer：癌癥途徑；Pancreatic cancer：胰腺癌；Neuroactive ligand-receptor interaction：刺激神經(jīng)組織的中的交互；Long-term depression：長期抑制作用；GnRH signaling pathway：促性腺激素信號通路；Gap junction：細胞間隙鏈接；Fc gamma R-mediated phagocytosis：FcγR介導(dǎo)的吞噬作用。

此外，在模型對照組和對照組以及模型對照組和鴨油甘油二酯組之間選擇了13個重要的脂質(zhì)，從表4可以看出，這13種脂質(zhì)的含量較高。這些結(jié)果表明，13種脂質(zhì)，包括10種TG，2種CEs和1種FFA，可能是負責(zé)鴨油甘油二酯降脂作用的潛在生物標志物。

表4 潛在的脂質(zhì)生物標志物

3 討 論

高脂食物是造成肥胖的關(guān)鍵，張潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，藿香可以起到減肥的作用，前人對甘油二酯的降脂作用也做過研究，但對于鴨油甘油二酯的降脂方面的作用和機理研究還處于空白階段，通過脂質(zhì)組學(xué)研究飲食和生物代謝之間的作用，可以很好地解釋它們之間的相互作用[15]。本研究中，我們結(jié)合了體重、腹脂率、臟體比、血清生化指標和脂質(zhì)代謝組學(xué)來分析研究鴨油甘油二酯對肥胖大鼠的影響以及潛在的機制。

3.1 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠體重和體脂的影響

長期攝入甘油二酯能夠控制體重增加，并減少內(nèi)臟脂肪含量[16]。而很多疾病的發(fā)生都是由于脂肪在體內(nèi)蓄積造成的，例如高血脂、高血壓等。王峰[17]研究發(fā)現(xiàn)，1,3甘油二酯替代普通油脂可明顯降低體重。有研究表明，肥胖人群攝入甘油二酯6周至6個月，能夠有效的降低體重，減少皮下脂肪以及內(nèi)臟脂肪[18]。本試驗結(jié)果得出，與模型對照組相比，鴨油甘油二酯組的體重、腹脂率均顯著降低，與前人研究結(jié)果一致。

3.2 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠Lee’s指數(shù)的影響

世界衛(wèi)生組織將Lee’s指數(shù)作為評價成年人胖瘦程度的計量指標之一[19]，Lee’s指數(shù)反映了生物體的肥胖情況。彭燕群等[20]研究表明，Lee’s指數(shù)是反映大鼠肥胖程度的重要指標。程愛佳等[21]研究表明，肥胖與Lee’s指數(shù)有著密切的聯(lián)系，且Lee’s指數(shù)與脂肪含量呈正相關(guān)。本試驗結(jié)果得出，鴨油甘油二酯能夠降低Lee’s指數(shù)，控制體型發(fā)育，符合Lee’s指數(shù)與脂肪含量呈正相關(guān)，與前人研究結(jié)果一致。

3.3 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠臟體比的影響

作為試驗動物重要的生物學(xué)特性指標之一，臟器的相對大小在一定程度上可說明其功能的強弱和試驗動物的生理狀況[22]。李熠陽[23]研究發(fā)現(xiàn)，甘油二酯對小鼠的臟器沒有影響。本試驗結(jié)果得出，鴨油甘油二酯對心臟、脾臟、腎臟、睪丸等器官生長發(fā)育無顯著影響，與前人研究結(jié)果一致。周慧娟[24]研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的脂質(zhì)生成、轉(zhuǎn)化和代謝負擔(dān)加重會在一定程度上使肝臟系數(shù)增大，當這種負擔(dān)超過肝臟本身的代謝能力后，則會使脂質(zhì)過多沉積于肝臟，造成肝體肥大。本試驗中，鴨油甘油二酯可以減少肝臟脂質(zhì)積累，使肝體比下降，有效避免肝體肥大。

3.4 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠血清生化指標的影響

血清生化指標作為動物健康與否的基礎(chǔ)指標，在疾病診斷和治療過程中具有重要的參考價值[25]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨油甘油二酯可以降低血脂水平，維護脂類代謝正常進行。孟祥河[26]研究發(fā)現(xiàn)，甘油二酯能夠降低大鼠血清TC、TG含量，提高血清HDL-C含量，這與本試驗結(jié)果一致，其原因可能是鴨油甘油二酯無法參與正常的脂類代謝過程，從而降低大鼠血清TC、TG、LDL-C含量，提高血清HDL-C含量。

3.5 鴨油甘油二酯對肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

肝臟是人體最重要的能量代謝器官，通過調(diào)節(jié)脂肪酸、TG、膽固醇等脂類合成和分解代謝來維持脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[27]。Gorden等[28]研究發(fā)現(xiàn)，甘油二酯、TG、FFA含量異常增加是肝臟異常的標志。高膽固醇血癥被認為是膽固醇代謝的標志[29]，CE與膽固醇穩(wěn)態(tài)失調(diào)有著密切的聯(lián)系[30]。Zeng等[31]研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者的癌癥風(fēng)險顯著增加，而PC的代謝異常是癌癥的標志之一。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨油甘油二酯可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成和分解代謝之間的失衡。FFA的儲存不僅促進TG在肝細胞內(nèi)的異常積累，而且轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)中間體(甘油二酯、CER等)，破壞細胞功能，導(dǎo)致脂毒性，從而發(fā)展成肝脂肪變性，而鴨油甘油二酯的攝入有效減少了肝臟中FFA、甘油二酯等產(chǎn)物的積累，降低肝脂肪變性風(fēng)險。通過本試驗結(jié)果分析，鴨油甘油二酯降低肝臟中FFA、甘油二酯等產(chǎn)物的積累的原因是鴨油甘油二酯參與脂肪細胞的甘油酯代謝、產(chǎn)熱作用和脂肪分解調(diào)節(jié)途徑、磷脂酶D的信號通路、膽固醇代謝等代謝通路。

4 結(jié) 論

鴨油甘油二酯能夠起到減肥降脂、控制體型發(fā)育、降低血脂水平、維護脂類代謝正常進行的作用。并且進一步表明了鴨油甘油二酯影響脂質(zhì)代謝與抑制FFA、甘油二酯、TG等有關(guān)，改善了脂肪分解調(diào)節(jié)途徑等相關(guān)代謝通路。