慢性冷暴露對小鼠產(chǎn)熱及肝臟結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的影響

周萬慧 胡亞婕 張 萌 李曉雙 徐 彬 楊玉英 李 鵬 李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,動物醫(yī)學基礎(chǔ)國家級實驗教學示范中心,黑龍江省牛病防治重點實驗室，大慶 163319)

冷應(yīng)激是常見的環(huán)境應(yīng)激源之一。低溫條件下動物機體脂肪分解加快，自身產(chǎn)熱以維持核心溫度[1-4]。肝臟作為營養(yǎng)物質(zhì)代謝、免疫、內(nèi)分泌等生理過程的關(guān)鍵樞紐，其脂質(zhì)代謝紊亂將會造成代謝性相關(guān)疾病，如非酒精性脂肪肝、糖尿病等。因此，探究慢性冷暴露下小鼠產(chǎn)熱及肝臟脂質(zhì)代謝水平的變化，為慢性冷暴露對機體損傷的防治提供參考和理論依據(jù)十分重要。肝臟脂質(zhì)代謝的調(diào)控方式包括攝取血漿中的脂肪酸、脂質(zhì)從頭合成(denovolipogenesis，DNL)、脂質(zhì)的β氧化以及極低密度脂蛋白的運輸[5-6]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1, SREBP1)通過誘導脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)和乙酰輔酶A羧化酶1(acetyl coenzyme A carboxylase 1,ACC1)的mRNA表達調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)脂質(zhì)從頭合成[7-9]。肉堿棕櫚轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)和肉堿棕櫚轉(zhuǎn)移酶2(carnitine palmitoyl transferase 2，CPT2)將脂肪酸轉(zhuǎn)運入線粒體以促進脂質(zhì)分解[10]。有研究表明，急性冷暴露條件下，大鼠胰島素水平下降，血漿中游離脂肪酸含量增加，葡萄糖氧化增加[11]。同時此條件下小鼠肝臟內(nèi)酮體含量增加，脂質(zhì)分解基因表達增強[12-13]。持續(xù)禁食可以使肝臟內(nèi)脂肪酸β氧化水平增加，為機體提供ATP并促進肝臟內(nèi)糖異生[14]。目前，對于慢性冷暴露下小鼠的產(chǎn)熱以及肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達研究較少。因此，為探究慢性冷暴露對機體產(chǎn)熱、肝臟組織結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白表達的影響，本試驗根據(jù)團隊前期構(gòu)建的慢性冷暴露模型，對8周齡C57BL/6小鼠進行為期21 d的慢性冷暴露。冷暴露結(jié)束后檢測小鼠血液葡萄糖及甘油三酯含量；觀察肝臟組織形態(tài)；檢測肝糖原含量以及肝臟脂質(zhì)合成蛋白SREBP1和FASN，分解蛋白CPT1、CPT2，過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha, PPARα)的蛋白表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒及碘酸雪夫氏(PAS)染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液均購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司；增強型化學發(fā)光試劑(ECL)顯色液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國默克密理博公司。斯瑪特生化檢測試劑盤購自成都斯瑪特科技有限公司。

SREBP1(14088-1-AP)、FASN(10624-20AP)、CPT1(15184-1-AP)、CPT2(26555-1-AP)、PPARα(15540-1-AP)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體(20536-1-AP)、辣根過氧化物酶(HRP)山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG) (SA00001-2)、HRP山羊抗鼠IgG(SA00001-1)抗體均購自Proteintech公司。

1.1.2 主要儀器

全自動生化分析儀購自成都斯馬特科技有限公司；電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗設(shè)計

7周齡雄性C57BL/6小鼠(購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院試驗動物中心)36只，隨機分為2組，即慢性冷暴露組和常溫組，每組3個重復，每個重復6只小鼠。于人工氣候室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行試驗。慢性冷暴露每天給予4 ℃，連續(xù)隨機3 h冷刺激，冷刺激時間維持21 d，待冷刺激結(jié)束后進行樣品采集；常溫組飼養(yǎng)于(28.0±0.5) ℃人工氣候室。

1.3 試驗方法

1.3.1 血清葡萄糖以及甘油三酯含量測定

待冷暴露結(jié)束小鼠眼球采血。將采集血液放入真空采血管中并呈45°角傾斜放置于試管架上，室溫靜置1 h。3 000×g離心15 min分離血清。取100 μL血清放入生化試劑盤中進行檢測。

1.3.2 HE染色

頸椎脫臼法處死小鼠，摘取小鼠肝臟并用生理鹽水清洗，于4%多聚甲醛常溫固24 h。將固定的肝臟組織進行常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，制作成厚度為5 μm的切片。二甲苯脫蠟、酒精水化、HE液染色5 min，隨后脫水、二甲苯透明、樹脂封片，光學顯微鏡觀察肝臟組織病理變化。

1.3.3 PAS染色

采樣、固定及切片步驟同HE染色。二甲苯脫蠟、酒精水化、高碘酸-雪弗染色，之后進行蘇木素染色、脫水、二甲苯封片，光學顯微鏡下觀察肝臟糖原分布情況,計算肝糖原含量。

1.3.4 組織蛋白提取

取80 mg肝臟組織放入EP管，置于冰上勻漿；在EP管中加入配有PMSF的裂解液，配比為PMSF∶RIPA=1∶100。之后置于冰上裂解大約0.5 h，期間對其渦旋振蕩數(shù)次；裂解完畢后放入預冷4 ℃離心機，轉(zhuǎn)速為12 000×g，離心10 min，取上清；對吸取的上清即提出的組織蛋白根據(jù)蛋白濃度測定說明進行濃度調(diào)節(jié)，將樣品蛋白濃度調(diào)整一致；加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液并充分混勻，水浴鍋煮沸10 min使蛋白變性，冷卻至室溫。

1.3.5 Western blot

根據(jù)SDS-PAGE凝膠試劑盒說明配制所需濃度的凝膠；將所提蛋白點入膠孔，恒壓50 V進行電泳；在樣品進入分離膠后恒壓120 V進行電泳；之后利用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，根據(jù)蛋白大小設(shè)定時間；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后脫脂乳室溫封閉PVDF膜約1 h，TBST清洗3遍，10 min/次；根據(jù)條帶大小孵育對應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，之后對PVDF膜進行清洗；室溫孵育二抗，對PVDF膜進行清洗。使用ChemiDos XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行曝光。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

PAS染色肝糖原含量使用Image J1.8.0軟件統(tǒng)計；試驗使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性冷暴露對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

圖2所示為肝臟組織切片HE染色結(jié)果。由圖可見，慢性冷暴露條件下小鼠肝臟組織與常溫組相比視野下出現(xiàn)大量空泡樣變。

A：常溫組小鼠肝臟組織HE染色；B：慢性冷暴露組小鼠肝臟HE染色。

2.2 慢性冷暴露對小鼠血清葡萄糖及甘油三酯含量的影響

如圖3-A所示，與常溫組相比，慢性冷暴露條件下血清葡萄糖含量極顯著降低(P<0.01);圖3-B結(jié)果顯示與常溫組相比，慢性冷暴露條件下小鼠血清甘油三酯含量極顯著下降(P<0.01)。這說明機體此時對葡萄糖以及甘油三酯的消耗大大增加，供能需求增大。

*P<0.05；**P<0.01。n=18。下圖同。

2.3 慢性冷暴露對小鼠肝糖原含量影響

圖4所示為小鼠肝糖原含量測定結(jié)果。由圖4-C可以看出，小鼠經(jīng)21 d冷刺激后，肝糖原含量較常溫組顯著降低(P<0.05)。這說明慢性冷暴露條件下，小鼠體內(nèi)肝糖原在慢性冷暴露條件下得到動員。

A：常溫組小鼠肝組織PAS染色；B：慢性冷暴露組小鼠肝組織PAS染色；C：肝糖原含量。

2.4 慢性冷暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達的影響

圖5為脂質(zhì)合成過程中FASN、SREBP1的蛋白表達水平。由圖可知，經(jīng)3周冷暴露后FAS、SREBP1蛋白表達水平均發(fā)生顯著上調(diào)(P<0.05)。這說明肝臟經(jīng)慢性冷暴露后，其合成脂質(zhì)能力增強，脂質(zhì)動員增加。

A：FASN、SREBP1 Western blot結(jié)果；B：FASN蛋白表達水平；C：SREBP1蛋白表達水平。

2.5 慢性冷暴露對小鼠肝臟脂質(zhì)分解相關(guān)蛋白表達的影響

圖6所示為脂肪分解過程中CPT1、CPT2、PPARα的蛋白表達水平。小鼠經(jīng)21 d冷刺激后肝臟組織中CPT2蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。PPARα、CPT1蛋白表達趨勢與CPT2一致，經(jīng)冷暴露后，其蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。PPARα、CPT1和CPT2是脂肪分解過程中執(zhí)行β-氧化功能關(guān)鍵蛋白，由此可知慢性冷暴露使得小鼠肝臟脂肪分解顯著增加。

A： CPT1、CPT2、PPARα Western blot結(jié)果；B：CPT1蛋白表達水平；C：CPT2蛋白表達水平；D：PPARα蛋白表達水平。

3 討 論

動物機體具有復雜的生理機制，通過調(diào)控能量物質(zhì)的存儲與代謝來適應(yīng)外界環(huán)境的變化和滿足自身活動需求。當機體遭遇如禁食[15-16]、感染[17]、運動[18]等情況時，脂肪酸的β氧化會有所增加以維持能量供給。另外，外界環(huán)境中的冷熱刺激也是影響動物體內(nèi)能量物質(zhì)代謝的重要因素。本試驗對慢性冷暴露下小鼠血清葡萄糖、甘油三酯含量進行檢測； HE、PAS染色檢測肝臟組織病理損傷及糖原分布情況；Western blot檢測肝臟脂質(zhì)合成、分解過程相關(guān)蛋白表達水平。結(jié)果顯示慢性冷暴露條件下小鼠肝臟與對照組相比出現(xiàn)空泡樣變。這說明在低溫刺激下，肝細胞發(fā)生腫脹并出現(xiàn)穩(wěn)態(tài)應(yīng)激負荷范圍內(nèi)的損傷。葡萄糖、脂質(zhì)以及蛋白質(zhì)并稱為三大營養(yǎng)物質(zhì)。葡萄糖和脂質(zhì)之間可以進行相互轉(zhuǎn)化，在肝臟組織中，葡萄糖通過糖酵解過程生成的丙酮酸可以用于DNL；同時脂質(zhì)在機體功能不足情況下通過氧化分解轉(zhuǎn)化成葡萄糖[19-21]。本試驗發(fā)現(xiàn)慢性冷暴露致使小鼠血清葡萄糖含量降低，甘油三酯含量顯著下降。同時肝糖原含量也降低。Yao等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在急性冷暴露6 h時，小鼠血漿葡萄糖含量顯著下降，這與本研究結(jié)果趨勢大致相同。這說明在低溫環(huán)境下，機體所需能量增加，葡萄糖消耗量增大。

甘油三酯是重要的儲能物質(zhì)，本試驗發(fā)現(xiàn)慢性冷暴露下血清中甘油三酯含量顯著下降，與葡萄糖含量降低一致，說明在此條件下機體能量消耗較大。肝糖原作為葡萄糖分子聚合物，是一種重要的儲能形式。在禁食或空腹狀態(tài)，受胰島素和胰高血糖素調(diào)節(jié)，肝糖原分解增強[23]。經(jīng)慢性冷暴露后，小鼠肝臟組織糖原含量顯著降低，與Liu等[24]研究結(jié)果相符，表明慢性冷暴露條件使得小鼠肝臟內(nèi)糖原分解增強。以上說明冷刺激下，小鼠血清葡萄糖含量降低，肝臟可能通過加強肝糖原分解以維持機體血糖的穩(wěn)定。

本試驗通過Western blot對肝臟組織內(nèi)脂肪合成相關(guān)蛋白SREBP1和FASN表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)慢性冷暴露下肝臟組織內(nèi)SREBP1和FASN蛋白表達水平顯著增加。在營養(yǎng)缺乏條件下，癌細胞可以通過增加SREBP1以及FASN的表達增加脂肪的從頭合成，以維持細胞的能量需求[25]。另外有研究發(fā)現(xiàn)SREBP1、FASN基因在冷暴露1～5 d內(nèi)與常溫對照組相比，表達首先發(fā)生明顯下降，隨著刺激天數(shù)的增加，脂質(zhì)合成基因的表達較冷刺激第1天緩慢回升[26]。以上結(jié)果說明，在慢性冷暴露期間機體可能由于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)使得脂質(zhì)合成抑制效果減弱，肝臟脂質(zhì)合成因代償需要從原本合成抑制狀態(tài)變?yōu)橹|(zhì)合成增加的狀態(tài)。

肝臟內(nèi)酰基肉堿在低溫環(huán)境下可作為棕色脂肪產(chǎn)熱的燃燒原料[27]。本試驗結(jié)果顯示，肝臟內(nèi)用于脂質(zhì)分解的CPT1蛋白表達水平顯著升高；CPT2的蛋白表達水平極顯著升高，說明慢性冷暴露下，小鼠肝臟內(nèi)?；鈮A分解加快，機體供能增加。PPARα是過氧化物酶體脂肪酸β氧化的限速酶，將肝臟中PPARα基因敲除可顯著降低線粒體β氧化活性顯著[28-29]。本研究結(jié)果顯示，在慢性冷暴露條件下，PPARα蛋白表達水平變化趨勢與CPT1、CPT2一致，在慢性冷暴露下表達水平上升。這說明低溫環(huán)境下肝臟內(nèi)脂肪酸β氧化增加，脂質(zhì)分解增強。以上結(jié)果與Xu等[12,30]對低溫環(huán)境下組織脂肪分解情況的研究結(jié)果相符，表明在慢性冷暴露調(diào)節(jié)下，小鼠肝臟可以通過脂肪分解增加維持能量消耗。

在畜禽養(yǎng)殖中，冷應(yīng)激對動物生長發(fā)育、生產(chǎn)性能、免疫功能等方面均存在負面影響。有研究發(fā)現(xiàn)冷應(yīng)激能夠降低肉雞平均增重，顯著影響肉雞生長性能[31]。奶牛在輕度冷應(yīng)激下其年平均產(chǎn)奶量也會產(chǎn)生一定幅度的下降[32]。另外，冷應(yīng)激還可以抑制綿羊血清免疫和抗氧化能力[33]。本研究中小鼠在慢性冷暴露條件下，其機體能量需求增加，肝臟脂質(zhì)代謝加快，以此來適應(yīng)冷應(yīng)激，但長時間處于寒冷條件下勢必會影響機體呼吸、血液循環(huán)、免疫系統(tǒng)等一系列生理活動。因此，在實際生產(chǎn)中，應(yīng)加強飼養(yǎng)管理，適當添加維生素E、谷氨酰胺等抗應(yīng)激劑，提高機體抗氧化功能和免疫功能，減少冷應(yīng)激對機體的損傷。

4 結(jié) 論

① 慢性冷暴露下小鼠血清葡萄糖、甘油三酯、肝糖原含量均減少。

② 慢性冷暴露下肝臟發(fā)生穩(wěn)態(tài)應(yīng)激負荷范圍內(nèi)的損傷。

③ 慢性冷暴露下肝臟脂質(zhì)合成蛋白SREBP1和FASN，分解蛋白CPT1、CPT2以及PPARα的表達均有所增加。

綜上所述，慢性冷暴露下機體通過增加肝臟脂質(zhì)合成及分解蛋白表達，增加血清葡萄糖、甘油三酯及肝糖原消耗，加快產(chǎn)熱，以抵抗慢性冷暴露對機體的損傷。