飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲生理機(jī)能的影響

孫桂云 胡希怡 于 靜 王紅芳 劉振國 胥保華

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271000)

精氨酸是一種功能性必需氨基酸，在生物體生長發(fā)育過程中非常重要。在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，精氨酸是目前發(fā)現(xiàn)的功能最多的氨基酸，其不僅是合成蛋白質(zhì)的重要原料，也是機(jī)體內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)、多胺和肌酸等重要物質(zhì)的合成前體，在動(dòng)物的調(diào)控和營養(yǎng)代謝中起著重要的作用[1]。精氨酸在動(dòng)物體內(nèi)有2條直接代謝的途徑：一條途徑是在精氨酸酶(arginase,ARG)的作用下分解為鳥氨酸和尿素，鳥氨酸又經(jīng)多種酶催化合成多胺類物質(zhì)[2]；另一條途徑是在一氧化氮合酶催化下，結(jié)合氧生成NO和瓜氨酸，NO是一種小型雙原子氣體，在許多發(fā)育和生理過程中作為擴(kuò)散的第二信使。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，動(dòng)物飼糧越來越受到養(yǎng)殖業(yè)的重視，氨基酸作為飼糧蛋白質(zhì)的重要組成物質(zhì)也受到人們的廣泛關(guān)注，精氨酸在大多動(dòng)物中屬于必需氨基酸，機(jī)體內(nèi)不能合成，需要額外添加。周凡[3]研究表明，飼糧中精氨酸添加水平顯著影響了黑鯛的生長性能，并且指出了精氨酸和賴氨酸這2種堿性氨基酸之間的拮抗作用以及兩者在飼料中的配比，為黑鯛飼料的配制提供了參考依據(jù)。飼糧精氨酸添加水平對(duì)哺乳仔豬采食量、血液中氨基酸含量以及胰島素等激素水平都有顯著影響，適宜的精氨酸添加水平提高了哺乳仔豬的健康狀況[4]。以豆粕替代飼料中魚粉并添加精氨酸對(duì)點(diǎn)帶石斑魚腸道消化酶活性和后腸黏膜下層厚度、肌層厚度、皺襞高度均有顯著影響[5]。總之，精氨酸在哺乳動(dòng)物和水產(chǎn)動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用已有很大的發(fā)展。近幾年，精氨酸在昆蟲上的研究也越來越多。有研究表明，飼糧中添加L-精氨酸可促進(jìn)果蠅化蛹，縮短果蠅的化蛹時(shí)間，提高其蛋白質(zhì)水平，但會(huì)引起氧化應(yīng)激，降低繁殖力和壽命[6]。在免疫方面，飼糧中添加精氨酸可通過誘導(dǎo)合成NO限制瘧原蟲的發(fā)育，減少按蚊對(duì)該蟲的感染率[7]；當(dāng)給被寄生蟲感染的果蠅幼蟲喂食L-精氨酸時(shí)，其血細(xì)胞數(shù)量增加，并且精氨酸提高了幼蟲包裹寄生蟲卵的能力，增強(qiáng)了自身對(duì)寄生蟲的抵抗力[8]。蜜蜂的必需氨基酸包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸[9]。已有研究表明，在室內(nèi)飼養(yǎng)的蜜蜂幼蟲飼糧中添加L-精氨酸增強(qiáng)了粒細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)注射后的免疫激活[10]。目前已有研究報(bào)道了精氨酸對(duì)昆蟲生理作用的影響，但對(duì)蜜蜂的作用還未有研究。因此，本試驗(yàn)擬在飼糧中添加不同水平的精氨酸，研究其對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率、羽化率、抗氧化能力以及免疫力的影響，以期為意大利蜜蜂工蜂幼蟲的飼養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用精氨酸純度為99%，購自鄭州某化工產(chǎn)品有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)用意大利蜜蜂工蜂幼蟲取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂群。在2020年春、夏季節(jié)蜜粉源充足的情況下，從群勢相當(dāng)?shù)囊獯罄鄯滏⒚梅淙褐羞x取1日齡工蜂幼蟲1 200只。

1.3 試驗(yàn)飼糧

配制5種添加不同水平精氨酸的試驗(yàn)飼糧，其組成見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

將1 200只意大利蜜蜂工蜂幼蟲隨機(jī)分成5組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)48只。5組工蜂幼蟲分別飼喂精氨酸添加水平為0(對(duì)照組)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%的試驗(yàn)飼糧。將1日齡工蜂幼蟲用移蟲針從蜂房移到溫度適宜盛有200 μL試驗(yàn)飼糧的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板放置在實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱(溫度33 ℃，相對(duì)濕度55%)中，試驗(yàn)期間每天定時(shí)更換新鮮的試驗(yàn)飼糧，飼喂至6日齡末或7日齡初時(shí)，幼蟲會(huì)出現(xiàn)直立和排便現(xiàn)象，將幼蟲移至事先鋪好滅菌紙的24孔培養(yǎng)板進(jìn)行化蛹。每天檢查培養(yǎng)板并及時(shí)移出死亡的幼蟲，同時(shí)記錄白眼蛹數(shù)和新蜂數(shù)，以便計(jì)算化蛹率和羽化率。在試驗(yàn)過程中取4、6日齡幼蟲及6日齡幼蟲血淋巴測定相關(guān)酶、基因及生化指標(biāo)。

1.5 測定指標(biāo)

1.5.1 化蛹率與羽化率的測定

從試驗(yàn)第1天開始，每天記錄工蜂幼蟲的死亡數(shù)量，并及時(shí)清理死亡蟲體，直至存活幼蟲全部羽化出房，記錄白眼蛹數(shù)和新蜂數(shù)，計(jì)算化蛹率和羽化率：

化蛹率(%)=(白眼蛹數(shù)/試驗(yàn)幼蟲數(shù))×100；羽化率(%)=(新蜂數(shù)/白眼蛹數(shù))×100。

1.5.2 血淋巴生化指標(biāo)的測定

在1.5 mL離心管中加入少量的苯基硫脲，放置在預(yù)先制冷(0 ℃)的金屬浴中，選用40 μL規(guī)格的毛細(xì)血管吸取6日齡工蜂幼蟲的血淋巴，用吸耳球?qū)⒀馨痛等?.5 mL的離心管中，采集完立即將樣品放入-80 ℃保存。檢測時(shí)，用4 ℃離心機(jī)12 000×g離心5 min，取200 μL上清備用，采用日立7020型全自動(dòng)生化分析儀測定幼蟲血淋巴中膽固醇(cholesterol,CHO)、總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、尿素(urea,UREA)含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)活性。

1.5.3 精氨酸代謝、抗氧化及免疫相關(guān)指標(biāo)的測定

將4、6日齡工蜂幼蟲按照1∶9的質(zhì)量比加入一定體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)，進(jìn)行組織勻漿，4 ℃離心機(jī)12 000×g離心15 min，取上清測定ARG、鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、溶菌酶(lysozyme,LYS)、酚氧化酶(phenol oxidase,PO)活性與總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)。昆蟲ARG、CAT、LYS、PO酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，昆蟲ODC ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，T-AOC試劑盒購自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.5.4 精氨酸代謝、抗氧化和免疫相關(guān)基因表達(dá)的測定

使用Total RNA Kit Ⅱ試劑盒(OMEGA公司)提取4和6日齡工蜂幼蟲總RNA，用微量紫外可見分光光度計(jì)測定RNA的純度和濃度，用Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測目的基因的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)楸磉_(dá)穩(wěn)定的β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)，引物設(shè)計(jì)與合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，引物信息見表2。按照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全氏金生物技術(shù)有限公司)，利用美國AB17500儀器系統(tǒng)進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。

表2 引物信息

1.5.5 中腸形態(tài)

6日齡工蜂幼蟲中腸形態(tài)學(xué)檢測在武漢塞維爾生物科技有限公司協(xié)助下完成。蜜蜂腸道置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定，脫水后進(jìn)行包埋、切片，將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍攝和測量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Turkey檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率和羽化率的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%精氨酸組的化蛹率、羽化率均無顯著變化(P>0.05)，0.6%、0.8%精氨酸組的化蛹率、羽化率均顯著降低(P<0.05)，且0.6%、0.8%精氨酸組還顯著低于0.2%、0.4%精氨酸組(P<0.05)。

2.2 飼糧中添加精氨酸對(duì)6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.6%精氨酸組血淋巴中膽固醇含量無顯著變化(P>0.05)，而0.8%精氨酸組顯著降低(P<0.05)，且0.8%精氨酸組還顯著低于0.2%、0.4%和0.6%精氨酸組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組血淋巴中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和總蛋白含量無顯著變化(P>0.05)；0.2%、0.6%和0.8%精氨酸組血淋巴中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于0.4%精氨酸組(P<0.05)；0.8%精氨酸組血淋巴中總蛋白含量顯著低于0.2%、0.4%精氨酸組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組血淋巴中白蛋白含量無顯著變化(P>0.05)，0.2%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.2%精氨酸組還顯著高于0.4%和0.8%精氨酸組(P<0.05)。0.2%、0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組血淋巴中尿素含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，0.6%、0.8%精氨酸組還顯著高于0.2%、0.4%精氨酸組(P<0.05)。

表4 飼糧中精氨酸添加水平對(duì)6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴生化指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加精氨酸對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲精氨酸代謝相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，4個(gè)添加精氨酸組的ARG活性均無顯著變化(P>0.05)，但0.2%精氨酸組顯著高于0.6%、0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖1-A)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組ARG活性均無顯著變化(P>0.05)，0.6%精氨酸組顯著升高(P<0.05)，且0.6%精氨酸組還顯著高于0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖1-A)。

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組ODC活性均無顯著變化(P>0.05)，0.2%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.2%精氨酸組還顯著高于0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖1-B)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組ODC活性均無顯著變化(P>0.05)，而0.6%精氨酸組顯著降低(P<0.05)(圖1-B)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組ODC基因相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，而0.6%精氨酸組顯著降低(P<0.05)(圖2)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.6%精氨酸組ODC基因相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，但0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組均顯著升高(P<0.05)，且0.4%和0.8%精氨酸組還顯著高于0.6%精氨酸組(P<0.05)(圖2)。

圖2 飼糧中精氨酸添加水平對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲鳥氨酸脫羧酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲抗氧化能力的影響

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.6%和0.8%精氨酸組CAT活性均無顯著變化(P>0.05)，0.4%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.4%精氨酸組還顯著高于0.2%、0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖3-A)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.6%、0.8%精氨酸組CAT活性均無顯著變化(P>0.05)，0.2%、0.4%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.2%精氨酸組還顯著高于0.6%、0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖3-A)。

對(duì)于4、6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.6%精氨酸組T-AOC均無顯著變化(P>0.05)，但0.8%精氨酸組顯著升高(P<0.05)(圖3-B)。

圖3 飼糧中精氨酸添加水平對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲過氧化氫酶活性、總抗氧化能力的影響

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.8%精氨酸組CAT基因相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，而0.4%、0.6%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.6%精氨酸組還顯著高于其他添加精氨酸組(P<0.05)(圖4)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.6%精氨酸組CAT基因相對(duì)表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)，0.4%、0.8%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.4%、0.8%精氨酸組還顯著高于0.2%、0.6%精氨酸組(P<0.05)(圖4)。

圖4 飼糧中精氨酸添加水平對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲過氧化氫酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.5 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲免疫能力的影響

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，4個(gè)添加精氨酸組LYS活性均顯著降低(P<0.05)(圖5-A)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.4%、0.6%和0.8%精氨酸組LYS活性無顯著變化(P>0.05)，0.2%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)(圖5-A)。

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組PO活性無顯著變化(P>0.05)，而0.6%精氨酸組顯著降低(P<0.05)，且0.6%精氨酸組還顯著低于其他添加精氨酸組(P<0.05)(圖5-B)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%精氨酸組PO活性無顯著變化(P>0.05)，而0.6%、0.8%精氨酸組則顯著降低(P<0.05)，且0.6%、0.8%精氨酸組還顯著低于0.4%精氨酸組(P<0.05)(圖5-B)。

圖5 飼糧中添加精氨酸水平對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲溶菌酶、酚氧化酶活性的影響

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，4個(gè)添加精氨酸組LYS基因相對(duì)表達(dá)量均無顯著變化(P>0.05)，但0.2%精氨酸組顯著高于0.8%精氨酸組(P<0.05)(圖6-A)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組LYS基因相對(duì)表達(dá)量均無顯著變化(P>0.05)，0.6%精氨酸組則顯著升高(P<0.05)，且0.6%精氨酸組還顯著高于其他添加精氨酸組(P<0.05)(圖6-A)。

對(duì)于4日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，0.2%、0.4%和0.8%精氨酸組PO基因相對(duì)表達(dá)量均無顯著變化(P>0.05)，而0.6%精氨酸組則顯著降低(P<0.05)，且0.6%精氨酸組還顯著低于其他添加精氨酸組(P<0.05)(圖6-B)。對(duì)于6日齡幼蟲，與對(duì)照組相比，4個(gè)添加精氨酸組PO基因相對(duì)表達(dá)量均無顯著變化(P>0.05)，但0.2%精氨酸組顯著低于0.4%精氨酸組(P<0.05)(圖6-B)。

圖6 飼糧中精氨酸添加水平對(duì)4、6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲溶菌酶、酚氧化酶基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.6 飼糧中添加精氨酸對(duì)6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲中腸形態(tài)的影響

由圖7可知，6日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲已經(jīng)開始進(jìn)行中腸重建，中腸上皮細(xì)胞已經(jīng)完全退化，成蟲中腸與幼蟲中腸之間已形成清晰可見的間隙。從圖中還可以看出，添加低劑量精氨酸對(duì)中腸重建無明顯影響，但添加0.8%精氨酸則明顯縮小了成蟲中腸與幼蟲中腸之間的間隙。

a：對(duì)照組；b：0.2%精氨酸組；c：0.4%精氨酸組，d：0.6%精氨酸組；e：0.8%精氨酸組。IM代表成蟲中腸，LM代表幼蟲中腸。

3 討 論

3.1 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率和羽化率的影響

研究表明，缺乏必需氨基酸會(huì)阻礙蜜蜂的生長發(fā)育[9]。在自然蜂群中，常以飼喂花粉來提供蜜蜂發(fā)育所需的氨基酸。精氨酸對(duì)蜜蜂生長發(fā)育影響的研究較少，但在其他動(dòng)物中已有大量研究。封福鮮[11]發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加精氨酸顯著影響了瓦氏黃顙魚的生長性能，使其終末體重、增重率和特定增長率都有升高的趨勢。而在研究較多的果蠅昆蟲中，在果蠅的培養(yǎng)基中加入適量的精氨酸能夠加速果蠅的蛹化速度，提高它的蛋白質(zhì)水平[6]。本試驗(yàn)探究了精氨酸對(duì)工蜂幼蟲生長發(fā)育的影響，研究發(fā)現(xiàn)添加低劑量的精氨酸對(duì)幼蟲化蛹率、羽化率均無顯著影響，但添加高劑量的精氨酸增加了工蜂幼蟲的死亡率。由此可見，添加高劑量的精氨酸對(duì)工蜂幼蟲生長發(fā)育有不利影響。

3.2 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲血淋巴生化指標(biāo)的影響

昆蟲的血淋巴在體腔內(nèi)循環(huán)(血腔)具有多種生物功能，如生物分子、營養(yǎng)物質(zhì)和激素的運(yùn)輸[12-13]。有研究表明膳食甾醇(包括膽固醇和植物甾醇)可以通過脂蛋白在昆蟲前胸腺合成蛻皮激素，對(duì)昆蟲蛻皮發(fā)育有重要的作用[14]。劉軍等[15]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加精氨酸能夠提高斷奶仔豬肝臟中膽固醇、甘油三酯含量，增強(qiáng)斷奶仔豬的機(jī)體營養(yǎng)水平。此外，精氨酸可促進(jìn)尿素循環(huán)，使血氨轉(zhuǎn)化為尿素排出，維持體內(nèi)氮平衡。果蠅ARG在脂肪組織中表達(dá)，并將精氨酸水解為鳥氨酸和尿素[16]。本研究中，低劑量精氨酸對(duì)工蜂幼蟲血淋巴膽固醇含量無顯著影響，但0.8%精氨酸組血淋巴中膽固醇含量顯著降低，這可能是導(dǎo)致工蜂幼蟲蛻皮失敗的重要原因；添加精氨酸使工蜂幼蟲血淋巴中尿素含量顯著高于對(duì)照組，這可能是由ARG代謝活性增加導(dǎo)致的。

3.3 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲精氨酸代謝的影響

精氨酸經(jīng)ARG代謝產(chǎn)生鳥氨酸和尿素，鳥氨酸又經(jīng)ODC等多種酶代謝反應(yīng)，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)，氧化供能生成CO2[3]。ARG是在細(xì)菌、酵母、植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中普遍存在的一種酶，該酶不僅參與機(jī)體尿酸循環(huán)，還與機(jī)體病理過程密切相關(guān)。曾雯娉[17]在凡納濱對(duì)蝦幼蝦精氨酸需要量的研究中得出，適量添加精氨酸能夠提高ARG活性，其與特定生長率呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，飼糧中添加0.6%精氨酸顯著提高了6日齡工蜂幼蟲ARG活性，且添加0.2%精氨酸顯著提高了4日齡工蜂幼蟲ODC活性，說明飼糧中添加一定劑量的精氨酸能夠促進(jìn)工蜂幼蟲體內(nèi)精氨酸的代謝循環(huán)。

3.4 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲抗氧化能力的影響

抗氧化能力對(duì)于一個(gè)蜂群的發(fā)展至關(guān)重要。T-AOC反映了存在于組織或細(xì)胞中的抗氧化分子，特別是含硫醇的化合物的非特異性自由基清除能力[18-19]。CAT是一種源于生命體的活性物質(zhì)，它是機(jī)體內(nèi)氧自由基的頭號(hào)殺手，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有清除生物體內(nèi)自由基、保護(hù)細(xì)胞免受損害等多種作用。王世昌等[20]研究顯示，補(bǔ)喂瘤胃保護(hù)性精氨酸提高了綿羊血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性，增強(qiáng)了綿羊的抗氧化能力。研究表明，膳食中添加L-精氨酸可以通過增強(qiáng)抗氧化防御機(jī)制來預(yù)防敵草快誘導(dǎo)的大鼠氧化應(yīng)激[21]，精氨酸對(duì)人工飼養(yǎng)仔豬的抗氧化能力也有顯著提高[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼糧中添加0.4%精氨酸顯著提高了4、6日齡工蜂幼蟲的CAT活性及其基因相對(duì)表達(dá)量，與上述研究結(jié)果一致，說明飼糧中添加精氨酸可以提高工蜂幼蟲機(jī)體內(nèi)CAT活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

3.5 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲免疫力的影響

昆蟲是無脊椎動(dòng)物，缺少脊椎動(dòng)物的抗原抗體特性，但它們也有一套完整的免疫系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)應(yīng)激影響蜜蜂腸道微生物群，對(duì)蜜蜂的免疫和病原體的發(fā)育產(chǎn)生影響[23]。LYS是一種小分子抗菌肽，是從昆蟲的血淋巴中分離純化出來的抗菌因子之一，又稱其為細(xì)胞壁溶解酶，在昆蟲的體液免疫中扮演著重要角色。同時(shí)，它是一種非特異性免疫因子，能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層中的1，4-糖苷鍵[24]，同時(shí)也可促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)，優(yōu)化免疫應(yīng)答[25]。在瓦氏黃顙魚[11]和吉富羅非魚[26]的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加精氨酸提高了機(jī)體中LYS的活性，增強(qiáng)了魚體的免疫能力。在本試驗(yàn)中，飼糧中添加0.2%精氨酸顯著提高了6日齡工蜂幼蟲的LYS活性，添加0.6%精氨酸顯著增加了6日齡工蜂幼蟲的LYS基因相對(duì)表達(dá)量，表明飼糧中添加適量精氨酸能增強(qiáng)工蜂幼蟲的免疫力。

3.6 飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利工蜂幼蟲中腸形態(tài)的影響

在意大利蜜蜂中，幼蟲消化道由1個(gè)有氣孔瓣的前腸、1個(gè)未分化的中腸和1個(gè)由回腸和直腸組成的后腸構(gòu)成[27]。蜜蜂幼蟲的中腸是腸道中最寬的區(qū)域，由3種細(xì)胞組成：可合成消化酶、吸收營養(yǎng)的消化細(xì)胞，產(chǎn)生激素的內(nèi)分泌細(xì)胞和負(fù)責(zé)替代其他2種細(xì)胞類型的再生細(xì)胞[28]。在正常情況下，昆蟲中腸的形態(tài)改變只發(fā)生在變態(tài)期間，消化細(xì)胞死亡和上皮細(xì)胞重塑以形成成蟲中腸，發(fā)生中腸重建[27-29]。家蠶末齡幼蟲發(fā)生變態(tài)時(shí)，成熟的中腸細(xì)胞開始從基底膜局部分離，直至完全分離后中腸細(xì)胞被推入中腸腔最終被分解，同時(shí)下面再生細(xì)胞分裂形成新的上皮細(xì)胞[30]。本試驗(yàn)顯示，6日齡工蜂幼蟲的中腸出現(xiàn)了如上述中提到的幼蟲中腸和成蟲中腸，且有明顯的分裂痕跡，說明意大利蜜蜂末齡幼蟲也會(huì)進(jìn)行中腸重建來完成變態(tài)發(fā)育；同時(shí)，結(jié)果還表明，添加高劑量精氨酸可能不利于工蜂幼蟲中腸發(fā)生分裂。

4 結(jié) 論

飼糧中添加精氨酸對(duì)意大利蜜蜂工蜂幼蟲化蛹率和羽化率、抗氧化能力以及免疫力均有一定的影響，適量添加可以提高意大利蜜蜂工蜂幼蟲的抗氧化能力，而高劑量添加則會(huì)降低意大利蜜蜂工蜂幼蟲的化蛹率和羽化率，對(duì)生長發(fā)育有不利影響。