微生物飼料添加劑對固原黃牛生長性能和瘤胃微生物區(qū)系的影響

李茂龍 謝建亮 常 娟 王 平 劉超齊 王利軍 尹清強* 黨曉偉

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，鄭州 450046；2.固原市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，固原 756000；3.河南德鄰生物制品有限公司，新鄉(xiāng) 453000)

隨著社會和經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活水平日益提高，牛肉越來越受到廣大消費者的歡迎[1]，極大地促進了肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。飼料添加劑已經(jīng)成為動物飼糧中不可缺少的一部分，在提高動物生產(chǎn)性能和維護動物健康方面發(fā)揮著重要作用。提高肉牛的生長速度，將會為養(yǎng)殖戶帶來更高的經(jīng)濟效益[2]。當前，關(guān)于豬[3-4]和禽[5-6]的飼料添加劑研究日趨完善，反芻動物的飼料添加劑逐漸引起人們的關(guān)注[7]。米曲霉培養(yǎng)物、長柄木霉培養(yǎng)物和釀酒酵母具有調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系及提高飼料消化率的功能。本研究將由上述3種微生物混合制成的微生物飼料添加劑添加到飼糧中，研究其對固原黃牛生長性能和瘤胃微生物區(qū)系的影響，評價微生物飼料添加劑在肉牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果，為其在肉牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微生物飼料添加劑

試驗用微生物飼料添加劑由35%米曲霉培養(yǎng)物(孢子數(shù)1.5億個/g)、35%長柄木霉培養(yǎng)物(孢子數(shù)1.8億個/g)、釀酒酵母30%(活菌數(shù)200億個/g)組成，該添加劑由河南某生物制品有限公司提供。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

選取體重[(306.20±14.31) kg]相近的12月齡固原黃牛56頭(公母各占1/2)，隨機分為對照組和試驗組，每組公母各2個重復(fù)，每個重復(fù)7頭公(母)牛，每個重復(fù)的公牛和母牛皆單圈飼養(yǎng)。對照組肉牛飼喂全混合日糧(total mixed ration,TMR)，該TMR參照《肉牛飼養(yǎng)標準》(NY/T 815—2004)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗組在對照組所喂TMR中添加2 g/kg微生物飼料添加劑。預(yù)試期7 d，正試期60 d，試驗期間試驗牛自由采食、自由飲水。

1)預(yù)混料為每千克TMR提供 The premix provided the following per kg of the TMR：VA 3 000 IU，VD3 800 IU，VE 8 IU，VK3 2 mg，Cu (as copper sulfate) 7 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 130 mg，Mn (as manganese sulfate) 30 mg，Zn (as zinc sulfate) 30 mg，Se (as sodium selenite) 0.077 mg，Co (as cobalt chloride) 0.31 mg，I (as potassium iodide) 0.256 mg。

1.3 指標測定

1.3.1 生長性能的測定

分別在試驗第1天、第30天和第60天稱重，同時記錄每日的采食量，用于計算不同階段的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G，F(xiàn)/G=ADFI/ADG)。

1.3.2 營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的測定

在正試期結(jié)束前連續(xù)3 d，每個重復(fù)每天采集3份新鮮糞樣約100 g，加10%硫酸冷凍保存，同時采集飼糧樣品。分別把每個重復(fù)采集的糞樣混合均勻，在65 ℃烘干后粉碎。飼糧和糞便干物質(zhì)(DM)含量采用烘干恒重法[8]測定，粗蛋白質(zhì)(CP)含量參照GB/T 6432—2018測定，粗脂肪(EE)含量參照GB/T 6433—2006測定，鈣(Ca)含量參照GB/T 6436—2018測定，磷(P)含量參照GB/T 6437—2018測定，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、纖維素(cellulose)和半纖維素(hemicellulose)含量參照Van Soest等[9]的方法測定，酸不溶灰分含量參照GB 5009.4—2016測定。營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率使用酸不溶灰分(AIA)作為內(nèi)源指示劑進行測定。

1.3.3 瘤胃發(fā)酵參數(shù)的測定

正試期第58天晨飼前，每個重復(fù)隨機挑選1頭牛，用瘤胃管由食道插入瘤胃中抽取瘤胃液，棄去前200 mL再抽取100 mL瘤胃液，分裝30 mL瘤胃液至50 mL離心管，-20 ℃冷凍保存，用于測定瘤胃液pH、揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)和氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量。使用ICS150型離子色譜儀(德國Sykam)測定瘤胃液中乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid,PA)、異丁酸(isobutyric acid,IA)和丁酸(butyric acid,BA)含量，使用比色法[10]測定瘤胃液中NH3-N含量，使用pH計測定瘤胃液pH。

1.3.4 瘤胃液微生物區(qū)系的測定

取瘤胃液時分裝3～5 mL凍存管并投入液氮罐，24 h后移入-80 ℃冰箱保存。將瘤胃液樣品送至上海派森諾生物科技有限公司進行微生物區(qū)系測定。首先，采用Illumina平臺對樣品群落DNA片段進行雙端(paired-end)測序，即細菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域；其次，用DADA2方法[11]進行去引物、質(zhì)量過濾、去噪、拼接和去嵌合體等步驟獲得ASVs(application sequence variants)；最后，通過QIIME2的classify-sklearn算法[12](https://github.com/QIIME2/q2-feature-classifier)將每個ASVs的特征序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(Rlease 13.8，http://greengenes.secondgenome.com)[13]進行比對，用Naive Bayes分類器進行物種注釋。

1.4 ADG及NDF和ADF表觀消化率與瘤胃微生物區(qū)系的相關(guān)性分析

通過Genescloud平臺(https://www.genescloud.cn)，使用Spearman等級相關(guān)系數(shù)算法對瘤胃微生物區(qū)系與ADG及NDF和ADF表觀消化率進行相關(guān)性分析。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2016初步統(tǒng)計，再用SPSS 26.0軟件中的one-way ANOVA程序進行方差分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物飼料添加劑對肉牛生長性能的影響

由表2可知，經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)，雖然試驗組肉牛的ADG比對照組提高11.21%，但差異不顯著(P>0.05)；然而，在試驗后期(第31～60天)，試驗組肉牛的ADG比對照組顯著提高19.05%(P<0.05)。由此可見，肉牛在長期食用含微生物飼料添加劑的飼糧后，微生物飼料添加劑才能發(fā)揮其促生長作用。

表2 微生物飼料添加劑對肉牛生長性能的影響

2.2 微生物飼料添加劑對肉牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加微生物飼料添加劑使肉牛的NDF表觀消化率顯著提高4.00%(P<0.05)，ADF表觀消化率顯著提高12.11%(P<0.05)；其他營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率在試驗組和對照組之間無顯著差異(P>0.05)

表3 微生物飼料添加劑對肉牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

2.3 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表4可知，試驗組瘤胃液AA、PA、BA含量較對照組分別極顯著提高了56.36%、200.00%、150.00%(P<0.01)，pH較對照組顯著提高了2.71%(P<0.05),而IA含量則較對照組顯著降低了20.00%(P<0.05)。試驗組肉牛瘤胃液中氨態(tài)氮含量較對照組有所有降低，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

2.4 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃液中微生物門水平相對豐度的影響

由圖1可知，肉牛瘤胃液微生物中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢菌門，其相對豐度之和達到95%以上。與對照組相比，試驗組厚壁菌門的相對豐度有升高趨勢，而擬桿菌門的相對豐度有降低趨勢。

圖1 瘤胃液微生物在門水平上的相對豐度

2.5 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃微生物屬水平相對豐度的影響

由圖2可知，不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、束毛球菌屬(Trichococcus)、沃氏黃桿菌屬(Wautersiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和肉食桿菌屬(Carnobacterium)為肉牛瘤胃微生物中相對豐度較高的前10個屬，占比超過50%。與對照組相比，試驗組不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、乳球菌屬、束毛球菌屬和類芽孢桿菌屬的相對豐度有升高趨勢，而假單胞菌屬、土壤芽孢桿菌屬、叢毛單胞菌屬和沃氏黃桿菌屬的相對豐度有降低趨勢。

圖2 瘤胃液微生物在屬水平的相對豐度

2.6 ADG、NDF和ADF表觀消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物區(qū)系的相關(guān)性分析

由圖3可知，不動桿菌屬相對豐度與AA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與IA含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與pH呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。嗜冷桿菌屬相對豐度與ADF表觀消化率、ADG和AA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與PA和BA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與IA含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。假單胞菌屬和叢毛單胞菌屬相對豐度分別與ADG、PA含量、BA含量和pH呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與AA含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與IA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。土壤芽孢桿菌屬和沃氏黃桿菌屬相對豐度分別與ADG和pH呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與AA、PA和BA含量呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與IA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。乳球菌屬、束毛球菌屬和類芽孢桿菌屬相對豐度分別與NDF表觀消化率、PA含量、BA含量和pH呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與ADF表觀消化率呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。圖3中的9個菌屬相對豐度與NH3-N含量皆無顯著的相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

NDF：中性洗滌纖維 neutral detergent fiber；ADF：酸性洗滌纖維 acid detergent fiber；ADG：平均日增重 average daily gain；AA：乙酸 acetic acid；PA：丙酸 propionic acid；IA：異丁酸 isobutyric acid；BA：丁酸 butyric acid；NH3-N：氨態(tài)氮 ammonia nitrogen。

3 討 論

3.1 微生物飼料添加劑對肉牛生長性能的影響

牛瘤胃環(huán)境和微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、生長性能和健康起到非常重要的作用。申紅春[14]的研究表明，在肉?；A(chǔ)飼糧中添加2.0%含有植物乳桿菌、戊糖片球菌、纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶和木聚糖酶的復(fù)合飼料添加劑可以提高其生長性能；Kelsey等[15]的研究表明，給斷奶犢牛每天每頭飼喂10 g含有糞腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和植物乳桿菌的益生菌可以提高犢肉牛的生產(chǎn)性能；Zhang等[16]的研究表明，給每頭犢牛飼喂1×1010CFU/d鼠李糖乳桿菌有利于瘤胃發(fā)育；Yao等[17]的研究表明，每頭犢牛飼喂5×109CFU/d巨大芽孢桿菌對犢牛的生長性能、免疫功能和腸道氧化狀態(tài)有明顯的改善作用；Du等[18]的研究表明，給生長遲緩犢牛飼喂4×1010CFU/d的淀粉溶解芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌均能促進犢牛生長發(fā)育。在本試驗中，微生物飼料添加劑對固原黃牛試驗前期(第1～30天)生長性能的提高作用沒有后期(第31～60天)明顯，可能是因為添加劑中的微生物在瘤胃內(nèi)定植發(fā)揮作用需要一定的時間[19]。微生物飼料添加劑通過影響肉牛瘤胃微生物區(qū)系，從而提高NDF和ADF的消化率，為肉牛提供充足的營養(yǎng)，進而促進肉?？焖偕L。

3.2 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

添加微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃內(nèi)環(huán)境有很大影響，結(jié)合瘤胃發(fā)酵參數(shù)與微生物區(qū)系的關(guān)聯(lián)熱圖可推測：微生物飼料添加劑通過影響有關(guān)菌群的相對豐度，進而影響瘤胃內(nèi)環(huán)境，從而促進肉牛的生長。瘤胃微生物發(fā)酵是反芻動物重要的能量來源途徑[20]。瘤胃內(nèi)環(huán)境的改變不僅可以影響牛的健康情況[21]，而且可以改變瘤胃微生物發(fā)酵的類型[22]。試驗組瘤胃液中AA、PA和BA含量均顯著高于對照組，說明試驗組發(fā)酵功能強于對照組，這與汪成等[23]報道的添加活性干酵母可以提高瘤胃內(nèi)總VAF含量的結(jié)果一致。試驗組瘤胃液pH顯著高于對照組，更利于抵抗酸中毒的發(fā)生，這與McCann等[24]報道的一致。試驗組瘤胃液NH3-N含量較對照組有降低趨勢，說明微生物飼料添加劑有利于瘤胃對氮利用率的提高，這與Erasmus等[25]的研究結(jié)果一致。

3.3 微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃微生物區(qū)系的影響

微生物飼料添加劑對肉牛瘤胃液中菌門和菌屬有一定的影響，使瘤胃內(nèi)有益微生物在豐度上占主導(dǎo)作用，這與Asai等[26]報道的瘤胃微生物區(qū)系主要受飼糧的影響是一致的。從門水平來看，厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門是瘤胃液中三大優(yōu)勢菌群，菌群數(shù)量的變化與瘤胃消化密切相關(guān)[27]，這與吳婷婷[28]報道的厚壁菌門與擬桿菌門是反芻動物瘤胃中兩大優(yōu)勢菌群的結(jié)果是一致的。B?ckhed等[29]和Xu等[30]報道，厚壁菌門和擬桿菌門共同作用于碳水化合物和蛋白質(zhì)的水解與合成。吳婷婷[28]和張玉瑩等[31]研究顯示，厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度比值越高越有利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收和能量存儲。本研究表明，試驗組厚壁菌門相對豐度升高，而擬桿菌門相對豐度下降，導(dǎo)致兩者相對豐度比值升高，有利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收和能量的存儲，與肉牛生長性能的提高相一致。

本研究表明，微生物飼料添加劑可提高肉牛瘤胃液中乳球菌屬、束毛球菌屬和類芽孢桿菌屬的相對豐度。據(jù)報道，乳球菌屬和類芽孢桿菌屬是動物胃腸道兩大類重要的益生菌，具有調(diào)節(jié)胃腸道微生物區(qū)系及分解植物細胞壁多糖和纖維素的功能[32-33]；束毛球菌屬可以代謝多糖、氨基酸、多元醇，甚至能降解纖維素[34-36]。由此可知，微生物飼料添加劑可通過提高肉牛瘤胃中木質(zhì)纖維素分解菌的相對豐度，達到提高NDF和ADF消化率的目的，從而提高肉牛的生長性能。

4 結(jié) 論

在固原黃牛TMR中添加2 g/kg微生物飼料添加劑可通過調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系提高其生長性能及NDF和ADF的表觀消化率。