飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)安格斯?fàn)倥ＩL(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)及糞便微生物區(qū)系的影響

薛帥帥 李亞飛 李可瑤 劉浩宇 黃彩云 郭娉婷 方紹明 梁學(xué)武 池春梅 甘乾福*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，寧德 355017)

犢牛養(yǎng)殖過(guò)程中存在腹瀉、斷奶應(yīng)激等眾多問(wèn)題，嚴(yán)重影響犢牛的健康，進(jìn)而造成養(yǎng)殖場(chǎng)的重大經(jīng)濟(jì)損失。如何改善犢牛健康和提高其生長(zhǎng)性能，對(duì)犢牛生產(chǎn)具有重要意義。0～6月齡的牛通常被稱為犢牛，由于其消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟[1]，此階段生理功能急劇變化，抵抗力差[2]，在斷奶階段的犢牛表現(xiàn)的尤為明顯，造成其后期的生長(zhǎng)速度緩慢且機(jī)體素質(zhì)變差，還會(huì)影響成年后生長(zhǎng)性能的發(fā)揮[3]。

抗生素的大量使用帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也會(huì)使細(xì)菌病毒產(chǎn)生耐藥性，對(duì)環(huán)境和人類健康造成危害。近年來(lái)，使用益生菌類添加劑取代抗生素已成為新趨勢(shì)。有研究顯示，丁酸梭菌、乳酸菌和布拉迪酵母等益生菌類添加劑可有效降低犢牛腹瀉率[4-5]，改善動(dòng)物健康，提高生長(zhǎng)性能[6-8]。自2020年7月1日起，我國(guó)已全面禁止在飼料中使用促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)，表明政府、消費(fèi)者和養(yǎng)殖從業(yè)人員對(duì)于食品安全和動(dòng)物養(yǎng)殖安全的越來(lái)越重視。益生菌類添加劑被認(rèn)為是具有安全、綠色、無(wú)殘留、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)的飼料添加劑，逐漸成為替代抗生素的熱門產(chǎn)品之一[9]。布拉迪酵母(Saccharomycesboulardii)是釀酒酵母的亞種，具有耐高溫、耐酸、耐膽鹽、抗氧化特性[10]。Datta等[11]研究表明，與釀酒酵母相比，布拉迪酵母在不同溫度及胃酸環(huán)境下的存活率更高，對(duì)膽鹽的耐受性更強(qiáng)，還表現(xiàn)出更優(yōu)的抗氧化特性，且均達(dá)到顯著水平。布拉迪酵母因其在防治幼畜腹瀉、提高機(jī)體免疫力、改善腸道屏障功能以及提高畜禽生產(chǎn)性能等方面具有良好的作用效果而被大力推廣應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等領(lǐng)域中[12]。

目前，布拉迪酵母在家禽、豬等單胃動(dòng)物上研究[13]較多，在反芻動(dòng)物上應(yīng)用的研究較少。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同劑量的布拉迪酵母對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能、血清免疫指標(biāo)及糞便微生物區(qū)系的影響，探究布拉迪酵母對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能和健康的影響，為犢牛無(wú)抗養(yǎng)殖提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用布拉迪酵母制劑(菌株編號(hào)：CNCM I-1079)由北京某生物科技有限公司提供，該制劑通過(guò)脂肪酸微膠囊包被技術(shù)進(jìn)行包被，布拉迪酵母有效活菌數(shù)為2.2×108CFU/g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，選用(152±10)日齡、體重[(116.50±17.81) kg]相近的健康安格斯?fàn)倥?4頭，隨機(jī)分為3組，每組8頭牛。對(duì)照組(CG組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加100(LG組)和200 mg/kg布拉迪酵母(HG組)。布拉迪酵母采用混合到基礎(chǔ)飼糧中的方式進(jìn)行添加。預(yù)試期14 d，正試期28 d。

飼養(yǎng)試驗(yàn)于2020年10～11月在福建省南平市某公司開展進(jìn)行。采用集體圍欄飼養(yǎng)，每欄8頭，圍欄面積為6 m×8 m，每日喂飼2次(08:00、14:30)，自由采食和飲水。每天清理犢牛欄，定期消毒。基礎(chǔ)飼糧和粗飼料分開飼喂，精粗比為30∶70?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。粗飼料(羊草)營(yíng)養(yǎng)成分含量為：干物質(zhì)(DM)89.0%，粗蛋白質(zhì)(CP)7.3%，中性洗滌纖維(NDF)65.5%，酸性洗滌纖維(ADF)42.2%。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 飼糧營(yíng)養(yǎng)成分含量

飼糧中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量分別參照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007的方法測(cè)定，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量參照Van Soest等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定，磷(P)含量采用釩鉬酸銨顯色法測(cè)定(UV-1780紫外分光光度計(jì)，日本島津)，鈣(Ca)含量采用高錳酸鉀檢測(cè)法測(cè)定。

1.3.2 生長(zhǎng)性能

于試驗(yàn)第1和28天晨飼前對(duì)所有試驗(yàn)牛進(jìn)行空腹稱重，分別記為初始體重和終末體重，計(jì)算平均日增重(ADG)；同時(shí)測(cè)量其體斜長(zhǎng)、體高及胸圍并計(jì)算體軀指數(shù)、體長(zhǎng)指數(shù)和胸圍指數(shù)。計(jì)算公式如下：

平均日增重(kg/d)=[終末體重(kg)-初始體重(kg)]/試驗(yàn)天數(shù)(d)；體軀指數(shù)(%)=[胸圍(cm)/體斜長(zhǎng)(cm)]×100；體長(zhǎng)指數(shù)(%)=[體斜長(zhǎng)(cm)/體高(cm)]×100；胸圍指數(shù)(%)=[胸圍(cm)/體高(cm)]×100。

1.3.3 血清免疫指標(biāo)

于試驗(yàn)第28天，全部犢牛晨飼前頸靜脈采血5 mL。將收集到的血液置于冰盒中低溫保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室離心(1 000×g)15 min。血清收集分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存待測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定血清中白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-l0)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，ELISA試劑盒購(gòu)自上海晶抗生物工程有限公司，所用儀器為酶標(biāo)儀(SYNERGY H11，美國(guó)BioTek)，具體操作參考說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.4 糞便樣品采集及糞便微生物多樣性檢測(cè)

糞便樣品于試驗(yàn)第28天晨飼前無(wú)菌采集犢牛直腸糞便，分裝至無(wú)菌凍存管內(nèi)，立即放入液氮罐中，-80 ℃保存待測(cè)。使用TGuideS96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取糞便基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用酶標(biāo)儀(Synergy HTX，美國(guó))檢測(cè)DNA濃度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rDNA序列的V3～V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10 μL：5 μL KOD FX Neo Buffer，2 μL dNTPs(2 mmol/L)，各0.3 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，0.2 μL KOD聚合酶，50 ng的模板DNA，ddH2O補(bǔ)充至10 μL。反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，隨后95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共循環(huán)25次，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%的瓊脂糖凝膠切膠回收，通過(guò)Illumina HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)(北京百邁客生物科技有限公司)對(duì)DNA片段進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)后再進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。

測(cè)序結(jié)束后，使用FLASH 1.2.11[16]和Trimmomatic 0.33[17]軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接過(guò)濾，通過(guò)UCHIME 8.1[18]去除嵌合體，得到高質(zhì)量的序列，使用Usearch 10.0在相似性為97%的水平上進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類，然后挑選出相對(duì)豐度最高的序列作為每個(gè)OTUs的代表性序列。利用RDP classifier 2.2構(gòu)建OTUs分類信息表。計(jì)算每個(gè)試驗(yàn)樣本的α多樣性和β多樣性。α多樣性由反映群落豐富度的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)、反映群落多樣性的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)及反映測(cè)序深度覆蓋度指數(shù)進(jìn)行評(píng)估。β多樣性選擇利用Bray-Curtis距離計(jì)算。利用線性判別分析效應(yīng)量(LEfSe)差異分析來(lái)計(jì)算不同組間的物種差異。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019進(jìn)行整理，應(yīng)用R軟件中的one-way ANOVA過(guò)程進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，試驗(yàn)第28天時(shí)，各組間犢牛的終末體重、平均日增重差異均不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛體尺指數(shù)的影響

由表3可知，LG組犢牛體高顯著高于CG組(P<0.05)，而CG組與HG組則差異不顯著(P>0.05)。各組間犢牛體斜長(zhǎng)、胸圍、體長(zhǎng)指數(shù)、胸圍指數(shù)、體軀指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛體尺指數(shù)的影響

2.3 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛血清細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，各組間犢牛血清IL-4和IL-10含量差異不顯著(P>0.05)。LG和HG組犢牛血清IL-6含量較CG組分別降低了43.18%、23.94%(P<0.01)，且HG組顯著高于LG組(P<0.05)。LG組犢牛血清TNF-α含量較CG組降低了18.57%(P<0.05)，而HG組較CG組則差異不顯著(P>0.05)，且HG組極顯著高于LG組(P<0.01)。

表4 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛血清細(xì)胞因子含量的影響

2.4 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便微生物區(qū)系的影響

2.4.1 OTUs稀釋曲線圖和糞便菌群的韋恩圖

由圖1-A可知，隨著測(cè)序深度增加，3組OTUs數(shù)量和物種豐富度持續(xù)增加，在測(cè)序深度超過(guò)5 000以后，OTUs數(shù)量仍持續(xù)增長(zhǎng)，而物種豐富度先緩慢增加后趨于平緩，表明測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中的細(xì)菌物種。

由圖1-B可知，在相似度為97%的水平下，3組共得到了1 226個(gè)OTUs，共有1 205個(gè)OTUs。CG、LG和HG組的OTUs數(shù)目分別為1 219、1 216、1 217個(gè)，其中獨(dú)有OTUs數(shù)目分別為3、1、1個(gè)。

CG1～CG8代表CG組的8個(gè)樣品，LG1～LG8代表LG組的8個(gè)樣品，HG1～HG8代表HG組的8個(gè)樣品。CG、LG、HG分別代表LG、LG、HG組。下圖同。

2.4.2 各組犢牛糞便菌群α多樣性分析

由表5可知，各組間的覆蓋率、Chao1和ACE指數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。LG和HG組的Simpson指數(shù)較CG組差異均不顯著(P>0.05)，但LG組顯著高于HG組(P<0.05)。LG組的Shannon指數(shù)顯著高于CG組(P<0.05)，而HG組較CG組則差異不顯著(P>0.05)，且LG組極顯著高于HG組(P<0.01)。

表5 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便菌群α多樣性的影響

2.4.3 各組犢牛糞便菌群β多樣性分析及相似性分析(ANOSIM)

用主坐標(biāo)分析(PCoA)對(duì)基于Bray-Curtis距離的樣品進(jìn)行相似性分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2-A可知，在主成分1貢獻(xiàn)率為15.4%，主成分2貢獻(xiàn)率為9.74%時(shí)，3組之間分布較近，說(shuō)明3組菌群多樣性差異較小。3組樣品組內(nèi)距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明組內(nèi)菌群多樣性差異較大。由圖2-B各組的ANOSIM統(tǒng)計(jì)分析圖可知，R=0.075>0，說(shuō)明組間差異大于組內(nèi)，P=0.066，說(shuō)明組間有顯著差異的趨勢(shì)。

圖2 犢牛糞便菌群主坐標(biāo)分析圖(A)和ANOSIM統(tǒng)計(jì)分析圖(B)

2.4.4 各組犢牛糞便菌群在門、科和屬水平上的組成和相對(duì)豐度

由圖3-A和表6可知，在門水平上，以厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)3種菌門為主，其相對(duì)豐度之和在92%以上。對(duì)微生物進(jìn)行組間差異性分析，在門水平未發(fā)現(xiàn)顯著差異的菌門。

表6 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便菌群門水平相對(duì)豐度的影響

由圖3-B和表7可知，在科水平上，主要包括瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)等。對(duì)微生物進(jìn)行組間差異性分析發(fā)現(xiàn)：LG組梭菌_vadinBB60群(Clostridiales_vadinBB60_group)的相對(duì)豐度顯著高于CG組(P<0.05)，而丹尼絲菌科(Erysipelotrichaceae)的相對(duì)豐度顯著低于CG組(P<0.05)。HG組丹尼絲菌科的相對(duì)豐度顯著高于CG組(P<0.05)，而梭菌_vadinBB60群的相對(duì)豐度顯著低于CG組(P<0.05)。

表7 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便菌群科水平相對(duì)豐度的影響

由圖3-C和表8可知，在屬水平上，主要優(yōu)勢(shì)菌群有瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、理研菌科_RC9_腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、瘤胃球菌科_UCG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)、擬桿菌屬(Bacteroides)、艾克曼菌屬(Akkermansia)等。對(duì)微生物進(jìn)行組間差異性分析發(fā)現(xiàn)：LG組和HG組中dgA-11_gut_group的相對(duì)豐度顯著高于CG組(P<0.05)

表8 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便菌群屬水平相對(duì)豐度的影響

圖3 犢牛糞便菌群門水平、科水平和屬水平上的組成

LEfSe分析結(jié)果如圖4-A和圖4-B所示，在科水平上，與CG組比較，在LG組中芽孢桿菌科(Bacillaceae)和韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)的相對(duì)豐度增加，而丹尼絲菌科的相對(duì)豐度減少。在HG組中，丹尼絲菌科、伊格爾茲氏菌科(Eggerthellaceae)和芽孢桿菌科的相對(duì)豐度增加。屬水平上，與CG組比較，在LG組中纖維素降解菌屬(Cellulosilyticum)、瘤胃桿菌屬(Ruminobacter)、GWE2-31-10、梭菌屬(Lachnoclostridium_10)、毛螺菌科_NC2004群(Lachnospiraceae_NC2004_group)、GCA-900066575、狹義梭菌屬6(Clostridium_sensu_stricto_6)、賴氨酸桿菌屬(Lysinibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)的相對(duì)豐度增加，而毛螺菌科_XPB1014群(Lachnospiraceae_XPB1014_group)、Pygmaiobacter、[Anaerorhabdus]_furcosa_group和dgA-11_gut_group的相對(duì)豐度減少。在HG組中賴氨酸桿菌屬、狹義梭菌屬6、厭氧弧菌屬、Parvibacter和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度增加，而dgA-11_gut_group的相對(duì)豐度減少。

圖4 犢牛糞便菌群LEfSe分析

3 討 論

3.1 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛生長(zhǎng)性能的影響

幼齡時(shí)期是反芻動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程的重要階段，此階段與其潛在生長(zhǎng)性能的發(fā)揮有著密切聯(lián)系。平均日增重是犢牛生長(zhǎng)性能的重要指標(biāo)之一。布拉迪酵母屬于釀酒酵母的亞種，是唯一的真菌益生菌[19]；其與釀酒酵母相比，具有耐高溫、耐酸、抗氧化等特性[10-11]。Saha等[20]研究表明，布拉迪酵母可改善黑孟加拉山羊腸道對(duì)鈣的吸收，但對(duì)羔羊的生長(zhǎng)性能和其他血液參數(shù)無(wú)顯著影響。Villot等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充10×109CFU/d布拉迪酵母無(wú)法改善犢牛平均日增重等生長(zhǎng)性能，但可以減輕其腹瀉癥狀。此外，布拉迪酵母在犢牛不同生長(zhǎng)階段的作用效果不同。Galv?o等[21]的研究結(jié)果表明，布拉氏酵母和釀酒酵母對(duì)新生犢牛體重增加具有積極影響，而不是在斷奶后。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組犢牛平均日增重差異不顯著，這與前人研究結(jié)果類似。此外，由于本試驗(yàn)采用分欄飼養(yǎng)，只統(tǒng)計(jì)了每組犢牛的采食量，并未統(tǒng)計(jì)犢牛的個(gè)體采食量，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算個(gè)體牛的平均日采食量和料重比數(shù)據(jù)，這是本研究存在的不足之處。

體尺指數(shù)是動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的重要指標(biāo)之一，可以反映犢牛的體格發(fā)育狀況和生長(zhǎng)性能。Lesmeister等[22]通過(guò)犢牛飼養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)，在飼糧中添加酵母培養(yǎng)物能夠提高其體高和胸圍。在本試驗(yàn)中，LG組犢牛體高較CG組顯著提高，與上述研究結(jié)果類似。本試驗(yàn)還觀察到，各組間犢牛體尺指數(shù)均無(wú)顯著差異，說(shuō)明飼糧中添加布拉迪酵母并未影響犢牛體格發(fā)育，這可能與動(dòng)物年齡、階段和布拉迪酵母的添加量等因素有關(guān)。

3.2 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

細(xì)胞因子是由多種細(xì)胞受到刺激后分泌的小分子可溶性蛋白質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，因此測(cè)定細(xì)胞因子的產(chǎn)生是評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)的重要指標(biāo)。眾所周知，斷奶應(yīng)激等可能導(dǎo)致腸道屏障功能的破壞。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，微生物入侵會(huì)增加炎癥的風(fēng)險(xiǎn)[23]。TNF-α、IL-6是重要的促炎因子，其中TNF-α參與機(jī)體局部或系統(tǒng)反應(yīng)，能刺激免疫細(xì)胞合成IL-6等多種細(xì)胞因子[24]。IL-4為主要的抗炎因子，能夠促進(jìn)B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞免疫[25]。劉孟健等[26]研究顯示，添加0.3%布拉迪酵母壁多糖能夠顯著提高早期斷奶羔羊結(jié)腸黏膜中IL-10的含量。盧奇成等[27]研究結(jié)果表明，添加布拉氏酵母能顯著提高荷斯坦?fàn)倥Ｑ錓L-2和IL-4的含量，顯著降低血清IL-1β和TNF-α的含量。在本試驗(yàn)中，與CG組相比，LG和HG組犢牛血清TNF-α和IL-6含量顯著降低，但血清IL-4和IL-10含量在3個(gè)組間無(wú)顯著差異。這表明添加適量的布拉迪酵母能夠預(yù)防炎癥的發(fā)生，促進(jìn)腸道健康。

3.3 飼糧中添加布拉迪酵母對(duì)犢牛糞便微生物區(qū)系的影響

雖然在豬和家禽中已經(jīng)廣泛研究了益生菌對(duì)腸道微生物組成的影響[28]，但對(duì)犢牛腸道微生物區(qū)系的潛在影響少有報(bào)道。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)分析瘤胃微生物[29-30]和糞便[31-33]樣本，可更深入和準(zhǔn)確地反映犢牛胃腸道微生物的組成和多樣性的變化。

本試驗(yàn)的24個(gè)樣品的稀釋曲線都趨于平緩，說(shuō)明所采集的糞便樣本均能夠覆蓋絕大多數(shù)的微生物群落種類。本試驗(yàn)中，各組覆蓋度指數(shù)均高于0.99，測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)地反映犢牛糞便細(xì)菌群落種類和結(jié)構(gòu)。α多樣性分析可反映糞便微生物群落的豐富度和多樣性。Shannon指數(shù)越大，Simpson指數(shù)越小，群落多樣性越高[34]。本試驗(yàn)中，LG和HG組的Simpson和Shannon指數(shù)差異顯著，且LG組Shannon指數(shù)顯著高于CG組?？赡芤?yàn)樘砑硬祭辖湍秆a(bǔ)充了犢牛腸道的微生物數(shù)量，使菌群多樣性增加。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，隨著布拉迪酵母添加量的增加菌群多樣性有所降低，可能是布拉迪酵母添加量的增加抑制部分致病菌所導(dǎo)致的。有研究表明，布拉迪酵母細(xì)胞壁上的甘露聚糖對(duì)致病菌具有吸附能力，進(jìn)而減少致病菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附[35]。Czerucka等[36]和Ibáez等[37]研究結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌可以黏附到布拉迪酵母細(xì)胞壁上，并隨布拉迪酵母排出體外。也有研究表明，布拉迪酵母主要是通過(guò)對(duì)大腸桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等致病菌的結(jié)合，而不是通過(guò)與致病菌競(jìng)爭(zhēng)腸上皮細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)來(lái)阻止病原菌的黏附，從而起到抑制病原微生物定植的作用[13]。Morales-Amparano等[38]研究結(jié)果表明，布拉迪酵母通過(guò)無(wú)氧發(fā)酵的方式將胃腸內(nèi)容物中的碳水化合物分解成乳酸等有機(jī)酸，降低腸道內(nèi)的pH，從而達(dá)到抑制病原菌增殖的效果。此外，布拉迪酵母的小分子分泌物(如溶菌酶等抗菌物質(zhì))也可直接或間接起到抑制病原微生物增殖的作用[39]。布拉迪酵母通過(guò)抑制病原微生物的定植與增殖，促進(jìn)犢牛健康?；贐ray-Curtis距離的PCoA及ANOSIM分析結(jié)果表明，CG組和LG、HG組的糞便菌群結(jié)構(gòu)有顯著差異的趨勢(shì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，門水平上，犢牛糞便菌群以厚壁菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌，占總菌的88%以上，這與之前關(guān)于反芻動(dòng)物糞便微生物的研究結(jié)果[40]一致。厚壁菌門與碳水化合物和蛋白質(zhì)的吸收有關(guān)，而擬桿菌主要作用于非纖維物質(zhì)的降解[41]。本試驗(yàn)中，飼糧添加布拉迪酵母對(duì)糞便的優(yōu)勢(shì)菌門種類沒(méi)有影響。疣微菌門具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫的能力，腸道微生物可能通過(guò)影響其相對(duì)豐度的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)[42]。本試驗(yàn)中，疣微菌門是第3優(yōu)勢(shì)菌門，飼糧中添加布拉迪酵母降低了疣微菌門的相對(duì)豐度，表明飼糧添加布拉迪酵母可能會(huì)影響犢牛的后腸道免疫功能。

在科水平上，瘤胃球菌科、理研菌科、毛螺菌科、普雷沃氏菌科等是主要優(yōu)勢(shì)菌科。瘤胃球菌科和毛螺菌科是厚壁菌門成員，都具有豐富的作用于碳水化合物的活性酶[43]。理研菌科和普雷沃氏菌科是擬桿菌門的主要細(xì)菌，含較多的活性酶，參與碳水化合物和蛋白質(zhì)的分解[44]。本試驗(yàn)中，LG組瘤胃球菌科、理研菌科和普雷沃氏菌科的相對(duì)豐度較CG組均有所下降，表明飼糧中添加布拉迪酵母可能降低對(duì)碳水化合物的利用率，從而降低飼料的轉(zhuǎn)化率。

在屬水平上，瘤胃球菌科_UCG-005、理研菌科_RC9_腸道群、瘤胃球菌科_UCG-010、擬桿菌屬、艾克曼菌屬等是主要優(yōu)勢(shì)菌屬。瘤胃球菌科_UCG-005、瘤胃球菌科_UCG-010是瘤胃球菌科成員，其中瘤胃球菌科_UCG-005與纖維降解有關(guān)，而瘤胃球菌科_UCG-010則是產(chǎn)丁酸菌[45]。腸道丁酸鹽的產(chǎn)生促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，增強(qiáng)上皮屏障的完整性，抑制促炎癥反應(yīng)[46]。本試驗(yàn)中，與CG組相比，HG組提高了瘤胃球菌科_UCG-005的相對(duì)豐度，降低了瘤胃球菌科_UCG-010的相對(duì)豐度，表明飼糧中添加布拉迪酵母可提高對(duì)纖維的利用率，但有增加炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，隨著腹瀉的加劇，麝鹿糞便中理研菌科_RC9_腸道群的相對(duì)豐度顯著降低[47]。擬桿菌屬能夠產(chǎn)生分解纖維素的酶，從而提高飼料的利用率，使動(dòng)物能夠更好的吸收。在本試驗(yàn)中，LG和HG組理研菌科_RC9_腸道群和擬桿菌屬的相對(duì)豐度較CG組均提高，表明添加布拉迪酵母可提高腸道對(duì)纖維素的降解率，防止腹瀉的發(fā)生。Fujisaka等[48]則證明艾克曼菌可以改善腸道屏障功能、增厚黏膜層，并且對(duì)糖代謝有促進(jìn)作用，其數(shù)量的增加有助于緩解炎癥性腸病癥狀[49]。在本試驗(yàn)中，LG和HG組艾克曼菌屬的相對(duì)豐度在后腸道中所占的比例均下降，表明添加布拉迪酵母可能引起后腸道的黏膜炎癥。

通過(guò)LEfSe分析，找到組間有顯著差異的物種。本試驗(yàn)中，LG和HG組中芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬、梭狀屬、厭氧弧菌屬的相對(duì)豐度均增加。芽孢桿菌等幾種益生菌已被廣泛用作益生菌類添加劑。Zhang等[50]研究表明，在飼喂布拉迪酵母的斷奶仔豬結(jié)腸中，芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加，具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗炎功效。本試驗(yàn)中添加布拉迪酵母可提高芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度，與上述研究結(jié)果一致。有研究表明，酵母菌與芽孢桿菌配伍生產(chǎn)的釀酒酵母培養(yǎng)物，能產(chǎn)生更多的營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)[51]，可顯著提高反芻動(dòng)物消化率[52]。因此，我們推測(cè)布拉迪酵母是通過(guò)與芽孢桿菌產(chǎn)生協(xié)同作用，提高飼料的消化率，改善胃腸道健康。以上結(jié)果表明布拉迪酵母在維持機(jī)體健康方面具有有益的作用。

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加布拉氏酵母對(duì)犢牛的生長(zhǎng)性能無(wú)顯著影響，可提高犢牛體高，降低血清IL-6和TNF-α含量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，改善糞便微生物區(qū)系，促進(jìn)犢牛健康。

② 本試驗(yàn)中，飼糧中添加100 mg/kg布拉迪酵母的效果最佳。