飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟脂肪代謝和膽汁酸代謝的影響

袁逸涵 申 宇 楊 燁

(長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，荊州 434000)

家禽低粗蛋白質(zhì)水平飼糧的使用不僅可以降低飼料成本，還可降低氮排放，從而減輕環(huán)境污染，因此，采用理想氨基酸模式配制的低粗蛋白質(zhì)水平飼糧(降低1%～2%粗蛋白質(zhì)水平)在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[1]，但低粗蛋白質(zhì)水平飼糧對家禽脂肪代謝和肝臟健康具有一定影響。研究表明，低粗蛋白質(zhì)水平飼糧會導(dǎo)致家禽腹脂、肝臟脂肪以及血清中甘油三酯(TG)含量增加，從而增加了患脂肪肝的概率[2-3]。特別是蛋雞，過度的脂肪沉積會導(dǎo)致蛋雞肝臟功能損害，造成脂肪肝出血綜合征(FLHS)，從而導(dǎo)致產(chǎn)蛋量下降，甚至死亡[4]。

家禽肝臟是脂肪代謝和膽汁酸(BAs)代謝的主要場所，肝臟脂肪代謝和BAs代謝異常是引起肝臟功能受損的主要原因。BAs是肝臟膽固醇代謝的終產(chǎn)物，法尼醇衍生物X受體(FXR)作為BAs受體，在調(diào)控BAs穩(wěn)態(tài)及脂肪代謝中具有重要作用，F(xiàn)XR表達(dá)異常會引起血清和肝臟脂肪含量的增加。相反，F(xiàn)XR激活會通過促進(jìn)過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)表達(dá)而降低肝臟脂肪水平。另外，F(xiàn)XR誘導(dǎo)激活小異源二聚體伴侶受體(SHP)的表達(dá)，與肝X受體(LXR)相互作用，從而抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的轉(zhuǎn)錄活性，降低肝臟脂肪沉積[5]。因此，本研究通過探討低粗蛋白質(zhì)水平飼糧對蛋雞育成雞肝臟脂肪代謝和BAs代謝的影響，闡明BAs代謝在肝臟脂肪代謝中的效應(yīng)，為低粗蛋白質(zhì)水平飼糧在蛋雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與設(shè)計

本試驗(yàn)選用體重相近、健康狀況良好的14周齡羅曼育成雞為試驗(yàn)對象，采用單因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計，將180只雞分為3組：CP-H組(飼糧粗蛋白質(zhì)水平為15.5%，高粗蛋白質(zhì)水平組)、CP-M組(飼糧粗蛋白質(zhì)水平為14.5%，正常粗蛋白質(zhì)水平組)以及CP-L組(飼糧粗蛋白質(zhì)水平為13.5%，低粗蛋白質(zhì)水平組)，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞。CP-M組試驗(yàn)飼糧粗蛋白質(zhì)營養(yǎng)水平參照NRC(2012)和羅曼蛋雞推薦標(biāo)準(zhǔn)[6]，CP-H組和CP-L組飼糧粗蛋白質(zhì)水平分別增加或降低1%，同時在低粗蛋白質(zhì)水平飼糧中添加賴氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、蘇氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)以使主要氨基酸(賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸、蘇氨酸)水平保持一致，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 15 000 IU，VD3 3 600 IU，VE 62.5 mg，VB1 3 mg，VB2 9 mg，VB6 6 mg，VB12 0.03 mg，煙酸nicotinic acid 60 mg，泛酸鈣calcium pantothenate 18 mg，葉酸 folic acid 1.5 mg，生物素 biotin 0.36 mg，氯化膽堿 choline chloride 900 mg，F(xiàn)e (as ferric sulfate) 247 mg，Zn (as zinc sulfate) 75 mg，I (as calcium iodide) 0.46 mg，Se (as sodium selenite) 0.06 mg。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)從14周開始到17周結(jié)束，試驗(yàn)記錄從15周開始(預(yù)試期為1周，采食CP-M組飼糧)，正試期為3周，在同一環(huán)境下采用籠養(yǎng)，雞舍溫度為(20±2) ℃，相對濕度為(50±5)%，自然通風(fēng)和光照。各組均為人工飼喂，每天定時定量喂料3次，自由飲水，其余飼養(yǎng)規(guī)程采用常規(guī)飼養(yǎng)方法進(jìn)行。

1.3 樣品采集

正試期第3周末，每個重復(fù)選取2只體重接近平均體重、健康狀況良好的蛋雞，禁食12 h，稱重后采用頸動脈放血法處死，并用15 mL離心管收集血液，于室溫3 000×g離心10 min，取上清于-80 ℃冰箱保存。肉雞屠宰后剝離腹脂，計算腹脂率，取腿肌、胸肌、肝臟放入自封袋于-20 ℃冰箱保存，以測定組織化學(xué)成分；取肝臟于液氮中快速冷凍，再于-80 ℃冰箱保存，以進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能測定

正試期開始，記錄每只蛋雞初重(IW)，試驗(yàn)期間記錄飼糧采食情況，試驗(yàn)期結(jié)束時記錄蛋雞末重(FW)，根據(jù)飼養(yǎng)試驗(yàn)記錄，以重復(fù)為單位計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.2 組織化學(xué)成分測定

胸肌、腿肌中的粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量分別用凱氏定氮法和索氏抽提法測定[7]。肝臟中總膽固醇(TC)和TG的含量使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定。

1.4.3 血清生化指標(biāo)測定

血清中TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、極低密度脂蛋白(VLDL)、尿酸(UA)、葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)的含量采用全自動生化儀(日立7600，日本)進(jìn)行測定，血清脂蛋白脂肪酶(LPL)活性采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)進(jìn)行測定。

1.4.4 肝臟BAs含量測定

肝臟BAs含量采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)進(jìn)行測定[8]。

1.4.5 基因定量表達(dá)(實(shí)時熒光定量PCR)

采用實(shí)時熒光定量PCR儀(CFX96 Real-time PCR system,Bio-Rad Laboratories,美國)檢測肝臟脂肪代謝相關(guān)基因——脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT/CD6)、脂肪酸合成酶(FAS)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(C/EBPβ)、LPL和載脂蛋白極低密度脂蛋白(apoVLDL)及BAs代謝相關(guān)基因——FXR和膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)相對表達(dá)量，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。引物序列見表2。

表2 基因引物序列

肝臟RNA的提取采用Trizol法進(jìn)行，利用RNA純化試劑盒對RNA進(jìn)行純化，其濃度和完整性用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，后保存于-80 ℃。得到的RNA用天根FastKing cDNA第1鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再按照KAPA通用型SYBR快速熒光定量PCR試劑盒以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量表達(dá)，其反應(yīng)過程為：95 ℃，3 min，然后95 ℃，3 s；60 ℃，34 s進(jìn)行40個循環(huán)，最后95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s完成反應(yīng)。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量[9]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SAS 9.2統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞生長性能的影響

由表3可見，整個試驗(yàn)期，各飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞的IW、FW、ADG、ADFI和F/G沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞生長性能的影響

2.2 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肌肉化學(xué)成分的影響

由表4可見，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對胸肌和腿肌蛋白質(zhì)含量無顯著影響(P>0.05)。CP-L組的胸肌和腿肌的脂肪含量、腹脂率、肝臟TG和TC含量顯著高于CP-M組(P<0.05)。

表4 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肌肉化學(xué)成分的影響

2.3 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可見，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對血清TC、HDL-C、LDL-C、VLDL、UA、TP含量具有顯著影響(P<0.05)，其中CP-L組的TC、HDL-C、LDL-C含量顯著高于CP-H組(P<0.05)，而VLDL、UA、TP含量顯著低于CP-H組(P<0.05)。

表5 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞血清生化指標(biāo)的影響

2.4 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟BAs含量的影響

由表6可見，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肝臟次級BAs石膽酸(LCA)、去氧膽酸(DCA)、熊去氧膽酸(UDCA)、β-鼠膽酸(β-MCA)含量具有顯著影響(P<0.05)，其中CP-L組的肝臟LCA、UDCA含量顯著低于CP-M組(P<0.05)，而DCA含量顯著高于CP-H組和CP-M組(P<0.05)，CP-H組的肝臟β-MCA含量顯著低于CP-M組(P<0.05)。飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肝臟初級BAs含量均沒有顯著影響(P>0.05)。

表6 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟BAs含量的影響

2.5 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞脂肪及BAs代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟BAs代謝相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果如圖1所示。CP-L組的FXR和CYP7A1基因相對表達(dá)量均顯著低于CP-H組(P<0.05)。

FXR: 法尼醇衍生物X受體 derivatives of Farnesol X receptor; CYP7A1: 膽固醇7α羥化酶cholesterol 7α hydroxylase。

由圖2可見，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)具有顯著影響(P<0.05)，其中CP-L組的FAT/CD6、FAS、C/EBPβ基因相對表達(dá)量顯著高于CP-H組(P<0.05)，LPL和apoVLDL基因相對表達(dá)量顯著低于CP-H組(P<0.05)。

FAT/CD6: 脂肪酸轉(zhuǎn)位酶 fatty acid translocase; FAS: 脂肪酸合成酶 fatty acid synthetase; C/EBPβ: CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β CCAAT/ enhancer binding protein β; LPL: 脂蛋白脂肪酶 lipoprotein lipase; apoVLDL: 載脂蛋白極低密度脂蛋白 apolipoprotein very low density lipoprotein。

3 討 論

3.1 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞生長性能的影響

育成期蛋雞的飼養(yǎng)任務(wù)就是培育出體重達(dá)標(biāo)、均勻度一致、健康狀態(tài)良好的后備蛋雞。本試驗(yàn)中通過對育成雞飼喂3種不同粗蛋白質(zhì)水平的飼糧發(fā)現(xiàn)，各組IW、FW、ADG、ADFI和F/G差異不顯著。由此可知，在滿足必需氨基酸需要的前提下，適當(dāng)降低飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞的生長性能不會造成顯著影響，這與陳曉慧等[10]和莊宏等[11]的報道結(jié)果一致。本研究的飼養(yǎng)試驗(yàn)期只持續(xù)了3周，時間相對較短，可能影響了飼糧粗蛋白質(zhì)水平對脂肪沉積和生長性能影響的效果，大部分育成期的飼養(yǎng)試驗(yàn)一般在5～7周[12-13]，但也有研究表明，短期飼養(yǎng)試驗(yàn)也能呈現(xiàn)一定的試驗(yàn)效果，飼喂3周發(fā)酵飼糧對海蘭褐育成雞的生長性能也會產(chǎn)生一定的影響效應(yīng)[14]，肉雞在持續(xù)采食2周的?；撬岷?，脂肪沉積也會發(fā)生明顯的變化[15]。本研究結(jié)果表明，短期飼養(yǎng)試驗(yàn)雖然對育成雞的生長性能沒有顯著影響，但肝臟脂肪沉積已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，對后期產(chǎn)蛋期的肝臟健康和產(chǎn)蛋性能可能會產(chǎn)生一定影響。

3.2 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞脂肪沉積的影響

家禽肝臟是體內(nèi)脂肪合成的重要器官，當(dāng)肝臟脂肪代謝異常、脂肪沉積增加將使家禽肝臟功能受損，從而引起脂肪肝或脂肪肝出血綜合征，導(dǎo)致蛋禽產(chǎn)蛋率下降、死亡率增加，是蛋雞生產(chǎn)中常見的一種營養(yǎng)代謝性疾病[16]。飼糧是調(diào)控肝臟脂肪代謝的主要因素，研究表明，低粗蛋白質(zhì)水平飼糧及低氨基酸飼糧是引起肝臟脂肪含量增加的主要原因[2,16-17]。肝臟脂肪含量與肝臟中脂肪合成、TG的分泌、游離脂肪酸(FFA)的吸收以及脂肪的氧化密切相關(guān)[18]。飼糧粗蛋白質(zhì)通過調(diào)控蘋果酸酶(ME)活性而調(diào)控肝臟脂肪酸(FA)的合成，增加飼糧粗蛋白質(zhì)水平會抑制肝臟ME活性，從而降低肝臟中FA的合成、脂肪沉積、TC含量以及血脂含量[19]。本研究表明，低粗蛋白質(zhì)水平飼糧不僅可以上調(diào)肝臟脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)，并且增加肌內(nèi)脂肪含量、腹脂率及肝臟TG的含量。

另外，低粗蛋白質(zhì)水平飼糧中必需氨基酸如Lys和Met的不足會使氨基酸不平衡，這是導(dǎo)致脂肪含量增加的主要原因[17]。一方面，當(dāng)Lys、Met等必需氨基酸不足時，肉毒堿合成能力下降，肉毒堿主要負(fù)責(zé)長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)(FA由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)并進(jìn)行β-氧化代謝)，因此，肉毒堿合成的減少將導(dǎo)致FA的氧化分解降低[20]；另一方面，氨基酸不平衡會增加氨基酸分解代謝，而碳骨架可能會轉(zhuǎn)化為合成碳水化合物和脂肪的中間代謝物，從而增加脂肪合成能力[2]。大量研究表明，在低粗蛋白質(zhì)水平飼糧中添加Met、精氨酸(Arg)、Thr會降低肝臟脂肪含量,本研究中，雖然低粗蛋白質(zhì)水平飼糧也添加了Lys、Met、Thr和Trp，但該組(CP-L組)育成雞的脂肪沉積也顯著增加，這可能還是飼糧粗蛋白質(zhì)水平對肝臟脂肪代謝的影響比較大。

家禽肝臟是脂肪合成的主要部位，但肝臟本身貯存脂肪的能力卻很低，正常情況下大部分脂肪通過與載脂蛋白結(jié)合形成脂蛋白的形式被運(yùn)輸?shù)礁闻K外組織分解貯存利用。VLDL是調(diào)控肝臟脂肪和FFA含量的關(guān)鍵因子，其主要功能是運(yùn)送內(nèi)源性的TG到肝臟外組織，而HDL是把外周組織FA及TC運(yùn)輸?shù)礁闻K的主要載體。因此，當(dāng)肝臟中VLDL合成或分泌降低時，肝臟脂肪增加，引起脂肪肝[21]，這與本研究結(jié)果一致。

3.3 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟BAs代謝的影響

BAs是TC分解代謝的終產(chǎn)物。肝臟中TC在CYP7A1催化下產(chǎn)生初級BAs(主要是CA和CDCA)，而腸道中的初級BAs在微生物作用下變?yōu)榇渭塀As(主要是LCA、DCA和UDCA)。大量研究表明，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對腸道微生物組成具有重要影響[22]，本研究表明，飼糧粗蛋白質(zhì)水平對次級BAs組成具有顯著影響，對初級BAs組成影響不大，這表明飼糧粗蛋白質(zhì)可能通過腸道微生物效應(yīng)而影響B(tài)As組成。

微生物的多樣性和豐度對次級BAs的形成具有顯著影響[23]。初級BAs在微生物膽鹽水解酶(BSH)和類固醇脫氫酶等酶作用下，通過脫氫、脫羥基和脫硫等形成次級BAs，而腸道乳桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、腸球菌(Enterococcus)、擬桿菌(Bacteroides)、梭菌(Clostridium)等主要微生物都會大量表達(dá)BSH[24]。因此，腸道中這些微生物的種類和豐度影響了腸道次級BAs的組成和水平。飼糧粗蛋白質(zhì)水平增加會導(dǎo)致家禽腸道一些致病菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)和彎曲桿菌(Campylobacter)的生長，抑制有益菌Bifidobacterium的生長[22]；降低飼糧粗蛋白質(zhì)水平則會顯著增加家禽盲腸Lactobacillus的數(shù)量[25]；Peng等[26]也發(fā)現(xiàn)，生長豬飼糧粗蛋白質(zhì)水平降低5個百分點(diǎn)能夠提高結(jié)腸微生物多樣性(Shannon指數(shù))，而腸道微生物引起的BAs模式的改變與肝臟脂肪沉積密切相關(guān)[27]。

3.4 飼糧粗蛋白質(zhì)水平對育成雞肝臟脂肪代謝的影響

BAs主要參與TC穩(wěn)態(tài)及脂肪代謝調(diào)控。研究表明，所有次級BAs(如DCA、GDCA、TDCA)與肝臟脂肪含量密切相關(guān)，BAs可通過激活FXR和SREBP-1c途徑，或抑制VLDL產(chǎn)生而調(diào)控脂肪合成[28]。FXR作為BAs受體，在調(diào)控BAs穩(wěn)態(tài)及脂肪代謝中具有重要作用。研究表明，F(xiàn)xr-/-小鼠肝臟脂肪、TC及TG沉積增加，而野生型小鼠使用BAs或FXR激動劑處理后，血清TC及TG含量下降。另外，F(xiàn)XR的誘導(dǎo)型基因成纖維細(xì)胞生長因子19(FGF19)會抑制脂肪合成及增加代謝。FXR激活會通過促進(jìn)PPARα表達(dá)而降低肝臟脂肪水平；另外，BAs還通過FXR誘導(dǎo)激活SHP表達(dá)，與LXR相互作用，從而抑制SREBP-1c的轉(zhuǎn)錄活性而降低FA、TG及VLDL的合成[5]。本研究表明，飼糧粗蛋白質(zhì)水平會導(dǎo)致肝臟BAs代謝模式發(fā)生變化，主要是低粗蛋白質(zhì)水平飼糧顯著降低了LCA、UDCA含量，而LCA、UDCA是FXR的激活劑[23]，因此CP-L下調(diào)了FXR的表達(dá)，從而導(dǎo)致肝臟脂肪沉積增加。低粗蛋白質(zhì)水平飼糧也增加了肝臟DCA含量，而DCA含量的增加與脂肪肝的產(chǎn)生密切相關(guān)[27]。另外，CP-H組肝臟中β-MCA含量相對較低，而β-MCA是FXR的抑制劑[29]，因此高粗蛋白質(zhì)水平會抑制肝臟中脂肪沉積。

4 結(jié) 論

家禽低粗蛋白質(zhì)水平飼糧配制技術(shù)不僅可以節(jié)約蛋白質(zhì)資源，還可以降低氮的污染。但本研究表明，13.5%低粗蛋白質(zhì)水平飼糧對育成雞肝臟代謝產(chǎn)生了影響，同時使肝臟脂肪沉積增加，并有增加脂肪肝的風(fēng)險。