加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平對(duì)糖尿病大鼠P38-MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的心肌纖維化影響

蔡素華，任禮錫 (廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510168)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病重要并發(fā)癥之一，同時(shí)也是造成糖尿病死亡的主要原因[1]。DCM的典型病理變化主要是心肌纖維化及心肌肥厚等，心肌病變的發(fā)生主要同糖尿病高血糖、高血脂狀態(tài)相關(guān)，可引起氧化應(yīng)激及相關(guān)線粒體功能障礙[2]。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)屬于一種可被細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等不同的細(xì)胞外刺激等激活的促分裂原活化蛋白激酶，可起到應(yīng)激調(diào)節(jié)及促炎性反應(yīng)的作用。加味芩桂術(shù)湯具有活血寧心、健脾利濕、溫陽化飲的功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其中的黃芪可改善T細(xì)胞功能及降低肺動(dòng)脈壓，減輕右前心負(fù)荷及松弛血管平滑肌，增加血流量[3]。奧氮平是非典型神經(jīng)安定藥，能夠拮抗多巴胺、5-羥色胺(5-HT)及膽堿能受體。然而關(guān)于加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平對(duì)于調(diào)節(jié)糖尿病大鼠P38-MAPK信號(hào)通路所介導(dǎo)的心肌纖維化的作用機(jī)制尚且不明確[4]?；诖?，本研究擬建立糖尿病大鼠模型，探討了聯(lián)合用藥的干預(yù)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料：選取70只清潔級(jí)雄性SD大鼠，平均體重(204.15±8.42)g。大鼠均自由覓食飲水，在20℃～25℃溫度及50%～55%濕度的環(huán)境下進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2試劑：奧氮平(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20010799，規(guī)格10 mg*7 s)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；兔抗鼠P38-MAPK抗體(北京博奧森公司)。

1.3方法

1.3.1造模：按30 mg/kg體重的劑量腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素，5 d后檢測(cè)血糖指標(biāo)不達(dá)標(biāo)者再按25 mg/kg體重的劑量腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為最后1次注射5 d后測(cè)定尾靜脈隨機(jī)血糖，認(rèn)為血糖≥16.7 mmol/L者為造模成功。

1.3.2分組：最終40只大鼠建模成功，然后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、加味芩桂術(shù)甘湯組、奧氮平組、加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組，每組各10只大鼠。其余的30只未建模成功的大鼠納入為對(duì)照組。模型組與對(duì)照組均給予0.9% NaCl溶液5 ml/(kg·d)，奧氮平組給予10 mg/d灌注。加味芩桂術(shù)甘湯組給予加味芩桂術(shù)甘湯，基礎(chǔ)組方如下：甘草6 g、酒軍8 g、麻黃8 g、桔梗 10 g、陳皮10 g、大腹皮10 g、川芎10 g、丹參30 g、黃芪30 g、茯苓30 g、葶藶子15 g、白術(shù)15 g、桂枝15 g。辨證加減，對(duì)紫紺嚴(yán)重者加澤蘭20 g；氣虛乏力者加人參10 g；腹脹納差者加厚樸15 g；痰多咯痰不爽者加萊菔子5 g、枳實(shí)5 g、半夏5 g。1次/d，連續(xù)8周。加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組同時(shí)給予兩種藥物干預(yù)。

1.4觀察指標(biāo)：各組均在喂養(yǎng)8周后處死大鼠，取組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察、超聲心動(dòng)圖檢查及P38-MAPK蛋白表達(dá)。①病理形態(tài)學(xué)觀察:稱重左心室重量，取心尖部分置于4%多聚甲醛固定48 h，固定的心肌組織脫水及石蠟包埋，制作切片后Masson染色、脫水、透明并封片固定，阿光鏡下觀察心肌細(xì)胞及膠原形態(tài)，采取計(jì)算機(jī)軟件定量分析心肌膠原含量。②超聲心動(dòng)圖檢查:實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，清晰顯示胸骨旁長(zhǎng)軸切面，測(cè)量舒張末期左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑、收縮末期左房?jī)?nèi)徑及左室射血分?jǐn)?shù)。③應(yīng)用Western印跡檢測(cè)P38-MAPK蛋白表達(dá)情況，主要取各組小鼠左心室心肌組織提取蛋白，經(jīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色及曝光后掃描，利用Image J圖像分析軟件做光密度分析，經(jīng)β-actin為內(nèi)參。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料不同組間參數(shù)的比較采用方差分析，對(duì)有差異結(jié)果進(jìn)一步采用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1病理形態(tài)學(xué)觀察：經(jīng)Masson染色，光鏡下顯示對(duì)照組大鼠細(xì)胞核呈深藍(lán)色，膠原纖維染成藍(lán)綠色，少量均勻分布，心肌細(xì)胞染成紅色。模型組大鼠心肌細(xì)胞間質(zhì)膠原纖維表達(dá)增加、排列紊亂及分布不均；加味芩桂術(shù)甘湯組、奧氮平組、加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組心肌膠原分布均勻，膠原表達(dá)量減少，具體以聯(lián)合組表現(xiàn)更為明顯。

2.2心臟血流動(dòng)力學(xué)：模型組在舒張末期左/右室內(nèi)徑、收縮末期左房?jī)?nèi)徑上比對(duì)照組更高，左室射血分?jǐn)?shù)比對(duì)照組更低，而經(jīng)不同治療方式的各模型組各指標(biāo)均改變，其中加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組變化最為明顯，同對(duì)照組接近度高。見表1。

表1 各組大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達(dá)：各組治療后心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達(dá)情況見表2，模型組水平最高，各治療組在指標(biāo)水平上均較模型組降低，其中以加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組降低最明顯，同對(duì)照組一致性高。見表2。

表2 各組大鼠心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

DCM是糖尿病典型病變，病機(jī)復(fù)雜，目前多數(shù)資料顯示P38-MAPK信號(hào)通路活化是關(guān)鍵機(jī)制，P38-MAPK信號(hào)通路促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子核因子κB活化，啟動(dòng)相關(guān)炎性因子轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，引起心肌纖維化，加劇DCM損傷[5-6]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠存在明顯P38-MAPK信號(hào)通路活化，而奧氮平組、加味芩桂術(shù)甘湯組、加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平組經(jīng)治療可有效抑制P38-MAPK信號(hào)通路活化，這樣發(fā)揮抗炎及抗心肌纖維化的目的，在大鼠各血流動(dòng)力學(xué)變化上，聯(lián)合組也更明顯，表明加味芩桂術(shù)湯聯(lián)合奧氮平作用突出。主要是加味芩桂術(shù)甘湯可起到活血寧心、健脾利濕、溫陽化飲的功效，現(xiàn)代藥理研究也顯示，黃芪能夠有效促進(jìn)慢性肺心病患者的T細(xì)胞功能，將患者肺動(dòng)脈壓降低，將其右心前負(fù)荷減輕，川芎能夠促使血管平滑肌松弛，將肺心血管擴(kuò)張，增加血流量，將微循環(huán)有效改善，將肺動(dòng)脈高壓降低，促使患者的心功能得到有效改善。奧氮平拮抗多巴胺、5-羥色胺(5-HT)及膽堿能受體，通過聯(lián)合作用可調(diào)節(jié)大鼠心臟功能，下調(diào)P38-MAPK信表達(dá)，抑制嚴(yán)重及抗心肌纖維化[7-8]。

綜上所述，加味芩桂術(shù)甘湯聯(lián)合奧氮平對(duì)糖尿病大鼠的心肌有保護(hù)作用，可能機(jī)制是下調(diào)P38-MAPK蛋白表達(dá)，這讓以P38-MAPK信號(hào)通路為切入點(diǎn)的治療方式提供理論及實(shí)踐依據(jù)。